溶血标本对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响

溶血标本对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响

雷建芳

江西省高安市立医院检验科330800

摘要：目的了解用实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA拷贝数时，溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。方法采集200例乙型肝炎患者血液，分离血清，置于-20℃冰箱保存备用，并同时配制出含不同浓度Hb血清管。采用实时荧光定量PCR方法，检测含不同Hb浓度及不含Hb血清的乙型肝炎病毒DNA拷贝数，用配对t检验进行统计处理。结果当标本中Hb浓度小于32g/L时，Hb对检测血清乙型肝炎病毒DNA拷贝数无显著影响（P＞0.05）。结论当Hb浓度较低时，Hb对血清乙型肝炎病毒DNA定量检测无显著影响，因此较低浓度溶血标本可以进行乙型肝炎病毒DNA的定量检测。

关键词：乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR

对象与方法

1.对象我们收集了ALT>50U/L、HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBcAb阳性的乙型肝炎患者200例，其中男性100例，女性100例，年龄在20～60岁之间。

2.试剂中山大学达安基因提供的乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒（批号：2015001）。

3.仪器ABX－60全自动血球计数仪、DA－7600荧光PCR扩增仪、高速离心机、干式恒温器、低温冰箱。

4.方法

（1）模拟溶血标本的制备：抽取200例乙型肝炎患者血液后，2小时内离心分离血清，这种不含Hb的血清作为无Hb对照组，然后取每位患者600μl血清及适量红细胞混合，置于-20℃冰箱保存备用。次日将含红细胞的血清管取出放于室温解冻，完全解冻后再将该管置于-20℃冷冻，如此反复冻融两次，使得RBC完全破裂，释放出Hb。在ABX－60全自动血球计数仪测定每管红细胞裂解后的Hb浓度，再用每位患者的血清稀释，使得Hb终浓度为4g/L、8g/L、16g/L、32g/L，这些标本即为模拟溶血标本。

（2）乙型肝炎病毒DNA模板制备。

（3）PCR扩增。

（4）核酸扩增与荧光数据采集。

（5）分析条件设定。

（6）数据分析。

5.统计学处理将测得的乙型肝炎病毒DNA拷贝数转换成常用对数，再利用SPSS软件包进行统计，各含Hb的血清组与无Hb的血清组间差异采用配对t检验进行差异性检验。

结果

Hb为4、8、16、及32g/L的血清组中乙型肝炎病毒DNA拷贝数与无Hb的血清组分别进行配对t检验，P值均大于0.05，因此每一组含Hb的乙型肝炎病毒DNA拷贝数与不含Hb的血清组均无显著性差异。

讨论

实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA已在临床广泛使用，但在临床应用中，影响的因素也较多，如实验室条件，操作人员的技术，临床标本的状态等。一些研究认为溶血标本对FQPCR技术检测乙肝病毒DNA有影响，但也有研究认为这种影响并不显著［2］。本文通过模拟不同程度溶血标本，认为溶血达到32g/L对检测结果无显著影响（P＞0.05）。陈英剑等认为溶血至20g/L时对检测结果无影响，这与本文研究结论基本一致［3］。

本文将乙型肝炎患者抽血后2小时内分离的血清作无Hb对照组，然后通过反复冻融使标本溶血，再用乙型肝炎患者自身血清稀释以获得不同Hb浓度溶血标本，在模拟不同程度溶血标本过程中，不添加任何外来物质，使检测结果受外在因素影响程度减少到最低。实验结果经统计处理后，发现溶血程度控制Hb的浓度在32g/L以下时，对乙型肝炎病毒DNA的检测结果无显著影响（P＞0.05）。出现此结果的原因可能有两个方面，一是在HBVDNA模板的提取过程中，标本中的Hb经100℃煮沸10分钟后已经变性沉淀，再经离心后，待测样本上清液中可能不会有Hb的存在，仅剩Hb的衍生物［4］。而且随着提取方法的不断改进，提取液中对DNA聚合酶的干扰物质不断减少，去除Hb越来越彻底。另一方面FQPCR对乙肝病毒DNA定量检测只是一种半定量方法，并不是对扩增后终产量进行完全定量，它是根据样本可检测的起始扩增时间与标准品扩增曲线得出的半定量结果。本文收集的30例病人的血清中HBVDNA含量均大于107拷贝/ml，样本中HBVDNA含量较高，血清中HBVDNA含量小于107拷贝/ml时，检测结果是否有差异，尚需进一步研究。且本文只对溶血程度小于32g/L时进行探讨，溶血大于32g/L时对检测结果的影响，也需进一步验证再作结论。溶血程度达到32g/L时已是肉眼非常清晰可见，临床溶血样本的溶血程度大多在32g/L以下，因此我们认为一般的溶血样本可以接受。但需注意的是，本文只是对深圳匹基公司试剂进行探讨，不同厂家，可能因使用不同的提取液及提取方法而出现不同的结论，有文献报道，使用PEG沉淀煮沸法和直接加热煮沸法提取HBVDNA所得的定量结果有差异，因此不同提取方法对检测结果有一定的影响［5］。一般而言厂家提供试剂时会给出较为清晰的影响试剂盒使用的各种因素，有能力的PCR实验室在试剂使用前，可进行此类评价实验，制订合适本实验室使用标本留取标准。随着卫生事业的发展，人们对检验质量的的要求越来越高，但检验质量不可避免的受较多因素影响，标本质量是重要的影响因素之一，如溶血、脂血、餐前、餐后等，对各项影响因素进行量化研究，如溶血、脂血达到何程度时则定为不合格样本，都应该有明确的指标。本文只对溶血程度小于32g/L时进行探讨，溶血大于32g/L时及血清中HBVDNA含量小于107拷贝/ml拷贝时对检测结果的影响，需进一步验证再作结论。

参考文献：

［1］黄翔，王日军，周志明，等.溶血和脂血标本中乙肝病毒DNA提取方法的选择与评价［J］.华中医学杂志，2004，28（02）：123-124.

［2］李金明，王露楠.样本处理对聚核酶链反应测定乙肝病毒核酸的的影响［J］.中华检验医学杂志，2000，23（6）：337-339.

［3］陈英剑，胡成进，齐法莲，等.溶血对荧光定量PCR检测HBVDNA结果的影响［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，2004，25（6）：563-564.

［4］陈晓东，陶志华，周武.核酸提取方法在聚合酶反应测定乙肝病毒核酸中的评价［J］.中华检验杂志，2002，25（04）：212.

［5］程正江，付文荣，曾平凡.荧光定量聚合酶链反应直接检测血清中乙型肝炎病毒核酸方法的建立及评价［J］.中华检验医学杂志，2004，27（2）：102-103.