马齿苋水煎液对怀孕小鼠子宫ERα和PR的影响

马齿苋水煎液对怀孕小鼠子宫ERα和PR的影响

陆伟娟李诗琪廖浪平唐霄豪黎琪望余天翊贺气志（通讯

长沙医学院湖南长沙410219

基金项目:[长沙医学院2016年大学生研究性学习和创新性实验计划项目长医教[2016]19号—60]

[摘要]目的以怀孕小鼠为研究对象，探索马齿苋水煎液对小鼠的抗生育影响。着重研究马齿苋对雌性小鼠子宫、卵巢、小鼠胚胎着床数量以及ERα、PR、mRNA的影响，来判断马齿苋是否具有抗生育作用。方法通过分组对照实验，观测高、中、低剂量灌胃怀孕小鼠后的的怀孕情况和子宫切片HE染色，测定ERα、PR在子宫中的表达。结果马齿苋可以激活H1受体，致使子宫平滑肌频繁收缩，干扰受孕早起胚胎着床。小鼠的子宫重量和小鼠胚胎着床数量随着马齿苋水煎液的剂量增加而递减（P<0.01），在HE染色中发现灌喂马齿苋水煎液的小鼠子宫内膜上皮细胞第6天还生长快速，子宫腔张开并产生分支，且脱膜分化失败。实验组小鼠子宫ERα和PR的mRNA水平也因马齿苋水煎液的浓度增高而明显升高(P<0.05)，严重影响子宫的接受状态。结论综上所述我们认为在怀孕初期马齿苋可使子宫平滑肌收缩、改变子宫形态、提高ERα和PR的mRNA水平的水平损害内膜接受能力，从而致使胚胎着床困难甚至失败，导致不孕不育。所以怀孕妇女，特别是怀孕初期应禁食马齿苋。

[关键词]马齿苋、受孕影响、小鼠子宫ERα和PR、抗生育

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)又名蚂蚱菜、长命菜、马舌菜等,为马齿苋科植物全草,多以其干燥地上部分入药,生于山区潮湿肥沃的地方,盛产于四川,遍布全国。马齿苋全草含有大量去甲肾上腺素\多量钾盐(硝酸钾、氯化钾、硫酸钾等)、二轻基苯乙胺、二羟基苯丙氨、酸(DOPA)、苯甲酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸及蔗糖、葡萄糖、果糖\谷胱甘肽、脂肪、糖、粗纤维、钙、磷、铁、胡萝卜素、硫胺素、核黄素、尼克酸等。性味酸寒,具有清热解毒、凉血止血之功效。主治热痢脓血、热淋、带下、痛肿恶毒、丹毒。马齿苋既可入药,又可食用,是我国卫生部划定的78种药食同源的野生植物之一,曾被列入2008北京奥运会的菜谱。国内近年来不少学者也多角度撰文介绍了马齿苋菜所含的营养成分及用途,如张兆洪、曹涤环等人较全面地介绍了马齿的营养成分和药用功能,指出马齿芜含有去甲肾上腺素、ω-3脂肪酸、黄酮等独特成分,具有治疗糖尿病、冠心病、高血脂等一些现代病的新用途。卢新华等用马齿觅多糖灌服小鼠数天，明显观察到小鼠腹腔巨唾细胞的吞嗟百分率提高，促进溶血素及溶血空斑的形成，促进淋巴细胞的转化，表明马齿觅多糖能提高免疫力。

值得一提的是马齿苋水煎液可以激活子宫平滑肌上的H1受体，对小鼠子宫具有兴奋作用，并且呈现剂量依赖性。现在马齿苋注射液也用于防治产后流血、电吸刮宫后子宫出血及不全流产等。虽然马齿苋能够影响受孕，甚至滑胎的负面报道已经很多，但马齿苋对受孕以及是否具有抗生育的影响国内外尚未有人研究，究竟报道是否属实也无理论基础支撑。所以，为了进一步了解马齿苋是否具有抗生育的作用，此次以受孕小鼠为模型，来探讨马齿苋对小鼠子宫、卵巢、小鼠胚胎着床数量以及ERα、PR、mRNA的影响。

1、材料与方法

1.1材料与动物

（1）饲养动养：健康昆明小鼠57只，体重20g±2g，普通级，小笼饲养，定量给食，昼夜自然变化。

（2）马齿苋水煎液的制备：采取一定量的马齿苋，加水没过药面，热抽提三次，过滤浓缩。最后将马齿苋水煎成含生药量为低浓度0.12g/ml、中浓度0.24g/ml、高浓度0.36g/ml的汤剂，置于冰箱，4℃保存备用。

1.2动物实验及组织准备

将共57只清洁级昆明小鼠试养1周后，每2只雌性小鼠与一只雄性小鼠合笼后过夜，第2天早上检查雌性小鼠是否有阴道栓，如果有，这天就定为此雌鼠怀孕后的第1天。共分两个动物实验项目。

实验项目一：从雌鼠怀孕后的第1天到脱颈处死的这一天，小鼠随机分为4组，分别为对照组、马齿苋低剂量组、马齿苋中剂量组、马齿苋高剂量组，每组12只。具体给药措施如下：分别为对照组每天灌胃等体积1ml生理盐水，马齿苋低剂量组每日以浓度为0.12g/ml的马齿苋水煎剂灌胃，1ml/只/天；马齿苋中剂量组每日以浓度为0.24g/ml的马齿苋水煎剂灌胃，1ml/只/天；马齿苋高剂量组每日以浓度为0.36g/ml的马齿苋水煎剂灌胃，1ml/只/天。到了第5天早上，通过尾静脉注射芝加哥天蓝染料(以便观察着床的胚胎)后，所有的实验动物脱颈处死，将子宫解剖出来，并统计各子宫中的胚胎着床数和子宫重量。

室验项目二：将15只灌服高剂量马齿苋水煎液处理的怀孕小鼠和15只生理盐水灌服的对照怀孕小鼠分别于怀孕后的第4，5，6天颈椎脱臼处死(D4，D5，D6，各5只怀孕小鼠)。解剖的子宫，一半固定在4%的多聚甲醛中用来做HE染色和免疫组化，一半保存在-80℃中用来做荧光定量。

1.3mＲNA提取，反转录及荧光定量

用E.Z.N.A.TMTotalＲNAKitⅡ(Omega)试剂盒提取子宫的总mＲNA，并用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa)试剂盒反转成cDNA，所有的步骤按照试剂盒使用说明书进行。荧光定量的试剂为SYBR@PremixExTaqTMⅡ(TliRNaseHPlus，TaKaRa)，ERα和PR的相应引物序列参考文献(Lietal.，2012)。β-actin的上游引物序列为5'-GGGAAATCGTGCGTGACATC-3'，下游引物序列为5'-GGAACCGCTCGTTGCCAATA-3'，自行设计。荧光定量的运行仪器为Bio-ＲadIQ5，退火温度均为60℃。

1.4HE染色

将固定在4%多聚甲醛中的子宫组织，PBS洗涤后脱水，切片，HE染色，树胶封固，光学显微镜下观察并拍照(OlympusDP73，Japan)。

1.5免疫组化

采用免疫组化SP法检测ERα、PR在子宫中的表达。使用的一抗为rabbitanti-ERα(1∶400，SantaCruz)和rabbitanti-PR(1∶300，SantaCruz)。所得结果通过Image-ProPlus6.0软件统计分析各蛋白的表达差别。

1.6数据统计

所有数据通过SPSS17.0软件分析，表达为Mean±SEM。P＜0.05表示显著差异，P＜0.01表示极显著差异。

2、结果与分析

2.1马齿苋对怀孕小鼠胚胎数量和子宫重量的影响

统计结果表明，通过对每一组实验小鼠与对照组实验小鼠的子宫重量和小鼠胚胎着床数量对比之后得知，怀孕小鼠的胚胎数量随着马齿苋水煎液的剂量增加而递减（P<0.01），空白组中小鼠胚胎数量平均为11-13个/只，当马齿苋水煎液浓度0.36g/ml时，小鼠胚胎数仅为8-9个/只，为对照组的60%。子宫重量也随着药物浓度增加而减轻(P<0.01)，空白组小鼠子宫平均重0.16g，当马齿苋水煎液浓度0.36g/ml时，实验组小鼠子宫平均重0.13g，约为对照组70%。具有显著差异。

2.2对子宫组织形态的影响

HE染色观察发现，当小鼠怀孕第6天，马齿苋水煎液浓度0.36g/ml时灌胃处死的小鼠子宫内膜上皮细胞生长快速，且子宫腔张开并产生分支，无脱膜分化现象，无着床胚胎。而对照组小鼠子宫生长正常，脱膜分化出现并成功着床。

2.3对子宫ERα和PR的影响

运用荧光定量和免疫组化的方法，对实验组和对照组小鼠的子宫ERα和PR进行了观测，通过对比结果得知，实验组的ERα和PR的mRNA水平明显升高（P<0.05），有显著差异。对照组ERα和PR的mRNA水平则正常。

3.讨论

经上述结果分析，马齿苋水煎液对受孕小鼠的具有明显的抗生育影响。一方面可能由马齿苋可以激活H1受体，致使子宫平滑肌频繁收缩，干扰受孕早起胚胎着床。另外实验结果也表明，小鼠的子宫重量和小鼠胚胎着床数量随着马齿苋水煎液的剂量增加而递减，呈现出明显的抗生育效果。HE染色发现灌喂马齿苋水煎液的小鼠子宫内膜上皮细胞第6天还生长快速，子宫腔张开并产生分支，且脱膜分化失败。正常时小鼠怀孕后第6天子宫内膜生长活动应停止，且脱膜分化成功。实验组小鼠子宫ERα和PR的mRNA水平也因马齿苋水煎液的浓度增高而明显升高。研究表明，子宫内膜接受能力受ERα和PR的共同调控，分别通过各自受体发挥作用，当ERα和PR水平明显上调时，会严重影响子宫的接受状态并导致着床失败。综上所述我们认为在怀孕初期马齿苋可使子宫平滑肌收缩、改变子宫形态、提高ERα和PR的mRNA水平的水平损害内膜接受能力，从而致使胚胎着床困难甚至失败，导致不孕不育。所以怀孕妇女，特别是怀孕初期应禁食马齿苋。

参考文献：

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