液相色谱仪检定过程中问题和维护讨论

液相色谱仪检定过程中问题和维护讨论

李超

盐城市计量测试所江苏盐城224017

摘要：色谱学是现代分析化学的一项重要分支，它既能用于微量组分的分析，又能用于大量的制备分离，应用范围已远超过其他各种分离检测方法，是实验室分析人员和生物化学专家研究分析中不可或缺的工具。随着液相色谱的广泛使用，作为计量检定人员，此文章对仪器检定中遇到的问题和解决方法进行探讨。液相色谱的计量检定需要仪器保持在一个良好稳定的运性状态，以下对液相色谱检定和维护中常遇的问题进行说明和分析。

关键词：液相色谱仪；检定；问题维护

1.液相色谱仪流路泵系统

泵系统主要是由输液泵和链接管路组成，正确配制和使用流动相，对保证泵流量的稳定性和保留时间的重复性十分重要。

1.1JJG705-2014《液相色谱检定规程》中规定液相色谱检定使用AR级100%甲醇作为流动相，因检定用到的标准物质萘的溶剂为甲醇，用纯甲醇作为流动相能更好的分析萘峰，采用其他流动相可能造成干扰。所用流动相必须经0.45μm微孔滤膜真空抽滤2~3次，用超声装置超声30min以上，方可作为流动相使用。用酸或碱来调节流动相pH值时，范围应在27.5pH[1]。

1.2检定时常常会遇到与实验室常用流动相不同的情况，更换流动相时应谨慎处理。若实验室刚使用过含盐的流动相，在检定前，不能直接换成甲醇作为流动相，以免造成盐类析出堵塞泵或者色谱柱。可先用超纯水作为流动相冲洗系统30min，再用甲醇水（含5%15%甲醇）冲洗，最后换成100%甲醇，保证没有盐类残留，形成对柱子和泵的保护。

1.3被检定的液相色谱若长期闲置或更换流动相时，有时会出现柱子压力在短时间内发生很大波动，导致检定无法正常进行，可考虑单向阀污染或阀内进入气泡。污染或气泡使得球和阀座之间密封不严，液体倒流，压力不稳。对于污染，可用不同极性的一系列溶剂冲洗，如25mL的水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷一次冲洗，或拆下单向阀放在10%的硝酸溶液内超声1小时，若仍不能解决问题考虑更换单向阀[2]。

排气泡时阀不易拧得过松，一般拧松2圈左右。拧的过松容易造成流动相进入泵头引起报警，气泡排出后压力恢复稳定关闭排气阀，这时待基线平稳方可进行检定。

1.4液相色谱检定中，要咨询实验人员系统是正相或反相，检定中用到纯甲醇作为流动相为反相系统，正反相流动相相互交换时要用互溶的中性溶剂进行中介替换。

2.进样系统

液相色谱的进样方式主要分为手动进样和自动进样，进样量直接影响峰高/峰面积的重复性。若重复性出现极大偏差，考虑排除进样系统的影响。

2.1手动进样器检定前应手动检查进样器是否渗漏。使用含盐的流动相后，要充分清洗，避免结晶堵塞。若已经造成堵塞，可逐段检查，把堵塞的管路拆装下来，反装在泵口处进行反冲。

2.2自动进样器目前自动进样器被广泛使用，它的优势是进样量准，进样快速。出现问题时，首先考虑针密封垫泄露，此时可将针设定在维修位置，更换新的密封垫后将针复位。自动进样器配针一般根据不同厂家配有不同型号，如用到被检单位经计量检定的针作为进样针，一定要配置好洗针液，建议采用甲醇：水=1：1的溶液作为洗针液，每次进样前设置洗针次数为3次以上。

3.色谱柱

色谱柱是液相色谱仪实现分离的核心部件，检定过程中涉及到色谱柱的常见问题为：色谱柱保留时间和分离度的重复性偏差过大，色谱峰出现拖尾等。色谱柱入口筛板堵塞会导致柱压升高，色谱峰拖尾和塔板数降低，当筛板部分堵塞或进口处填料塌陷行程异常峰时，可用强溶剂低速反冲色谱柱。为防止柱堵塞污染，检定过程中可以加装保护柱。

在分离过程中色谱柱固定相流失会显著降低柱子的使用寿命，所以在检定过程中选择长链烷基反相柱（如C8、C18）比较容易得到较好的稳定性[3]。另外，柱子的平衡时间不足也会影响峰型的不对称，进而影响定量定性的重复性。

4.检测器

检测器是高效液相色谱的三大关键部件之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，进行定性、定量分析。常见的有紫外检测器（UVD），示差折光检测器（RID），荧光检测器（UVD）。紫外检测器应用最为广泛，此处以其为例分析几种检定中常见问题和解决方法。

4.1UV灯若检定时发现基线长时间不能稳定或停泵后监测基线出现短噪音并偶伴长噪音信号，应考虑氘灯能量不足，此时更换新灯。在检定过程中，可先平衡柱子，等柱子平衡后再打开检测器，缩短氘灯使用时间，延长其使用寿命。

4.2检测器若基线一直向一个方向漂移且伴有毛刺，说明检测池内可能存在气泡。这时可以将检测器与泵出口直接相连，以不高过池耐压的流速冲洗几分钟，则一般可以排除气泡。

另外，示差折光检测器一般需要很长的稳定时间，建议提前一天设置好检定条件，提前开机预热，等仪器完全稳定后再进行相应的检定工作。

在实际检定过程中，很多企业和科研机构采用超高效液相色谱进行实验分析，超高效液相色谱在分辨率、灵敏度以及分析时间上都要优于常规液相。超高效液相色谱仪（UPLC）和高效液相色谱仪（HPLC）的主要区别就是其理论塔板数或柱效，它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度，但UPLC仍与HPLC同样的理论和原理，只是基于更细的（1.7µm）颗粒化学，使其具有更快的分析速度，增加灵敏度，增大组份分离度，增高系统反压的特点。

目前国家检定规程中尚未对超高效液相色谱仪的检定作出明确的说明，在检定中我们可参照JJG705-2014进行操作，一般在超高效液相检定时，会减小进样量，约3~5μL的10-4萘甲醇标准溶液，以免进样量过大造成峰型出现平峰。此外，超高效液相色谱仪的流动相流速也会对柱压产生明显影响，一般可以先按照规程采用1mL/min，若显示压力报警，可适当调低流速，待基线稳定后重新进样。超高效液相色谱仪（UPLC）还是一个迅速发展的崭新领域，对于它的检定过程日后必将逐步完善。

参考文献：

[1]崔福斋.生物矿化[M].北京：清华大学出版社，2007：90-98

[2]赵立平.液相色谱仪器的维护和故障排除.[J]现代仪器，2004：58

[3]BidlingmeyerBA.PracticalHPLCMethodologyandApplications[M].NewYork：Johnwiley&Sons，Inc.1992.1-26