积雪草苷对增生性瘢痕中肿瘤坏死因子αmRNA及Ⅰ型胶原表达的影响

积雪草苷对增生性瘢痕中肿瘤坏死因子αmRNA及Ⅰ型胶原表达的影响

李春梅1荣新洲2张涛2

李春梅1荣新洲2张涛2

（1中山大学中山眼科中心广东广州5100602广州市第一人民医院烧伤科广东广州510180）

【中图分类号】R273【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)16-0081-02

【摘要】目的探讨积雪草苷（Asiaticoside）对人增生性瘢痕中肿瘤坏死因子α（TumourNecrosisFactoralpha,TNF-α）mRNA及Ⅰ型胶原（TypeⅠCollogen）表达的影响。方法临床上收集烧伤后5-8个月增生性瘢痕标本18例，其中经积雪草苷治疗组和非积雪草苷治疗组各9例。采用原位杂交和免疫组织化学方法，分别检测增生性瘢痕中TNF-αmRNA及Ⅰ型胶原的表达水平，并利用图象分析方法进行结果分析。结果TNF-αmRNA在增生性瘢痕中主要表达于单核吞噬细胞胞浆，仅少部分表达于基底层细胞胞浆。经积雪草苷治疗的增生性瘢痕中TNF-αmRNA表达明显增多，胞浆浓染，统计学上明显高于非积雪草苷治疗组TNF-αmRNA表达（P<0.01）。Ⅰ型胶原表达于增生性瘢痕中，经积雪草苷治疗的增生性瘢痕中Ⅰ型胶原含量较少，排列整齐，与非积雪草苷治疗组有显著差异（P<0.05）。结论积雪草苷能促进增生性瘢痕中TNF-αmRNA的表达，减少Ⅰ型胶原合成，达到减轻瘢痕增生的作用。

【关键词】积雪草苷肿瘤坏死因子α增生性瘢痕Ⅰ型胶原

积雪草始载于《神农本草经》，1977年被《中国药典》收录并应用于临床。积雪草的主要成分包括积雪草苷（Asiaticoside）和羟基积雪草苷（Madecassoside）[1]。我们科于1995年开始应用积雪草苷制剂防治增生性瘢痕，发现其具有良好的减轻瘢痕增生的作用[2]，为进一步探讨积雪草苷减轻瘢痕增生的作用机制，临床上收集了烧伤后5-8个月经积雪草苷治疗和非积雪草苷治疗的增生性瘢痕标本各9例，采用原位杂交和免疫组织化学方法，分别检测并探讨增生性瘢痕中TNF-αmRNA及Ⅰ型胶原的表达水平。

材料与方法

1．药品，试剂及仪器：积雪草苷（肤康霜，肤康片）上海现代浦东药厂有限公司，沪卫药准字（1995）第028019号。TNF-αmRNA原位杂交试剂盒及Ⅰ型胶原多抗购自武汉博士得公司，二抗为丹麦DAKO公司EnVision系统。德国KONTRONIBAS2.5全自动图象分析系统，日本TVCky-F30B3-CCD彩色图象摄录输入仪。

2．临床资料：临床上收集烧伤后增生性瘢痕整形术后标本，选取烧伤后5-8个月内经积雪草苷治疗（肤康霜外用3次/天，肤康片6-8片/天）和非积雪草苷治疗的增生性瘢痕标本各9例。其中，男12例，女6例，火焰烧伤8例，热液烫伤10例，烧伤面积8%-96%，深ⅡO烧伤14例，ⅢO烧伤4例，主要位于四肢。瘢痕切取后立即置于液氮，然后-70℃冰箱保存，备用。

3．原位杂交：标本-70℃冰箱取出，集中冰冻10um系列切片后，经40g/L多聚甲醛-磷酸盐缓冲液固定15分钟，内含0.4g/L焦碳酸二乙脂（DEPC），以消除外源性RNA酶污染，采用TNF-αmRNA原位杂交试剂盒，操作按试剂盒说明书进行，操作中所有器皿均用1g/L的DEPC水处理，并200℃高温4h，灭菌灭酶。

4．免疫组织化学染色：标本经石蜡包埋，4um系列切片，采用Ⅰ型胶原多抗来研究增生性瘢痕中Ⅰ型胶原表达情况。具体操作采用二步法免疫组织化学染色，石蜡切片常规脱蜡至水，3%Ｈ2Ｏ2常温孵育20min，以消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗3次，抗原微波修复3分钟，磷酸盐缓冲液(PBS，0.1M、Ph7.2)洗涤3次，加入1∶300稀释的一抗，37℃孵育2h；滴加生物素标记的二抗常温孵育30min，PBS洗3次，二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染，常规封片。显微镜下观察，染成棕黄色为阳性单位，同时设不加一抗的非特异性对照。

5．组织学观察：在400倍光镜下观察原位杂交及免疫组化结果,每张切片随机选取10个视野，采用德国KONTRONIBAS2.5全自动图象分析系统，进行定量分析，计算平均阳性单位（PU）值[3]。PU值越小阳性单位越大。

PU=100×|Gα－GA|/（AAβ·Gmax）

6．统计学处理：所有数据均以PU值表示，采用成组设计资料t检验进行统计学分析。

结果

1．大体观察及组织学观察：所有标本均为烧伤后5-8个月增生性瘢痕整形术后标本，经积雪草苷治疗的瘢痕色泽暗红，质地较软；而非积雪草苷治疗的瘢痕颜色较红，表面粗糙，质地较硬。组织学观察可见经积雪草苷治疗的增生性瘢痕胶原含量较少，排列整齐；而非积雪草苷治疗的增生性瘢痕胶原含量多，排列紊乱。

2．原位杂交染色观察：增生性瘢痕中TNF-αmRNA主要表达于单核吞噬细胞胞浆，很少部分表达于基底层细胞胞浆。图象分析结果显示经积雪草苷治疗的增生性瘢痕中TNF-αmRNA表达明显增多，胞浆浓染，统计学上明显高于非积雪草苷治疗组TNF-αmRNA表达（P<0.01）。（见表1，附图1，图2）。

3．免疫组织化学观察：积雪草苷治疗的增生性瘢痕中Ⅰ型胶原的阳性表达淡染，图象分析结果显示Ⅰ型胶原含量较少；而非积雪草苷治疗的增生性瘢痕中Ⅰ型胶原的阳性表达浓染，胶原含量多（见表1），与积雪草苷组有显著性差异（P<0.05）（见附图3，图4）。

讨论

肿瘤坏死因子主要来源于脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）激活的单核吞噬细胞，可分为TNF-α和TNF-β两种类型，并通过与其受体结合而产生作用，其中TNF-α在增生性瘢痕形成过程中起重要作用。Castagnol[4]及Peruccio[5]等证实增生性瘢痕中TNF-αmRNA的含量显著减少，从而提出增生性瘢痕的形成与TNF-α合成减少有关。在本实验中，TNF-αmRNA原位杂交结果及图象分析结果显示经积雪草苷治疗的增生性瘢痕中TNF-αmRNA表达明显增多，统计学上明显高于非积雪草苷治疗组TNF-αmRNA表达（P<0.01），从而得出积雪草苷通过上调TNF-αmRNA在增生性瘢痕中的表达，以达到减轻瘢痕增生的作用。

另外，TNF-α还具有促进成纤维细胞调亡，减少Ⅰ型胶原合成的作用，其作用呈量效关系[6]，其作用机制可能是通过IL-1β/PGE2途径，抑制纤维连接蛋白的生成,增加胶原酶合成和前列腺素E2合成，从而促进Ⅰ型胶原的分解[7]。为了进一步验证TNF-α的抑制Ⅰ型胶原合成的作用，本实验应用免疫组化方法对增生性瘢痕中Ⅰ型胶原进行染色，图象分析结果证实经积雪草苷治疗的增生性瘢痕中Ⅰ型胶原的阳性表达含量较少，与非积雪草苷治疗组Ⅰ型胶原表达有显著性差异（P<0.05），这与积雪草苷治疗组增生性瘢痕中TNF-αmRNA表达增多相的结果一致。因此，我们可以得出积雪草苷可以通过促进增生性瘢痕中TNF-αmRNA的表达，减少Ⅰ型胶原的合成，从而达到减轻瘢痕增生的作用。

参考文献

[1]何明芳，孟正木，沃联群．积雪草化学成分的研究．中国药科大学学报，2000，31：91-9.

[2]张涛，荣新洲，杨荣华等，积雪草苷对增生性瘢痕中转化生长因子-βmRNA及基质金属蛋白酶类表达的影响.南方医科大学学报，2006，26(1)：67-70.

[3]申洪.免疫组织化学染色定量方法研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4：89-91.

[4]CastagnoliC,StellaM,BerthodC，etal．TNFproductionandhypertrophicscarring．CellImmunol．1993，147，51-63.

[5]PeruccioD，CastagnoliC，StellaM，etal．Alteredbiosynthesisoftumournecrosisfactor(TNF)alphaisinvolvedinpostburnhypertrophicscars．Burns，1994，20，118-121.

[6]KitzisV，EngravLH，QuinnLS．Transientexposuretotumornecrosisfactor-alphainhibitscollagenaccumulationbyculturedhypertrophicscarfibroblasts．JSurgRes，1999，87：134-141.

[7]FilippoR，MaurizioS，FrancescaL，etal.Invitomechanicalcompressioninducesapoptosisandregulatescytokines,releaseinhypertropicscars．WoundRepReg，2003，11，331-336.