中药肝复康对实验性阻塞性黄疸所致肝损害的预防作用

中药肝复康对实验性阻塞性黄疸所致肝损害的预防作用

秦冰

秦冰(辽宁省营口市中心医院普外科115001）

【摘要】目的观察中药肝复康对实验性阻塞性黄疸所致肝损害的预防作用。方法实验分3组。Ⅰ组：假手术对照组，Ⅱ组：阻塞性黄疸组，Ⅲ组：肝复康预防治疗组。观察指标包括血清直接胆红素、丙氨酸转氨酶、血清内毒素、肝细胞浆内游离钙和肝脏组织病理变化。结果Ⅱ组上述各指标水平均明显增高，而Ⅲ组均呈不同程度低值，与Ⅱ组相比差异有显著性（P＜0.05）。肝脏组织病理学显示，预防应用肝复康能显著减轻肝细胞变性、坏死及纤维组织形成。结论肝复康用于阻塞性黄疸所致肝脏损害的预防，可将抗内毒素血症与拮抗肝细胞浆内游离钙离子浓度升高的作用结合起来，有望延缓肝损害的进程。

【关键词】肝复康阻塞性黄疸肝损害大鼠

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）02-0022-02

本实验观察实验性阻塞性黄疸所致肝损害的程度及肝复康对肝损害的预防作用。现报告如下：

1材料与方法

1.1实验动物与分组

健康雄性SD大鼠74只，体质量180～220g，大连医科大学动物中心提供。随机分为3组。I组：假手术对照组，再分成3d、7d、14d3个亚组，每亚组8只；II组：阻塞性黄疸组，再分成3d、7d、14d3个亚组，每亚组8只；III组：肝复康预防治疗组，也分成3d、7d、14d3个亚组，每亚组9只。

1.2实验模型的制备

术前大鼠禁食15h，3%戊巴比妥钠（50mg/kg体质量）腹腔注射麻醉后，常规消毒，取上腹正中切口，II组和III组解剖肝蒂，显露胆总管，3-0丝线双重结扎并于其间离断胆总管，近端再结扎，造成胆道梗阻。I组仅游离胆总管后即关腹。

1.3给药方法及标本采集

I组与II组大鼠术后1d起给予生理盐水1ml/100g体重灌胃，1次/d作为对照；III组术后1d起给予肝复康（0.135g/2mL）1mL/100g体质量灌胃，1次/天。实验结束后，分别于3、7天及14d，在戊巴比妥钠（50mg/kg体质量）麻醉及严格的无菌操作下，采取下腔静脉血待测，取肝脏左外叶做病理检查。

1.4肝复康制剂

市大连医科大学附属第二医院临床应用的常规院制剂，方由当归5g、丹参5g、甘草3g、赤芍5g、黄芪10g、枳壳6g、柴胡3g组成，浸泡半小时水煮，浓缩至100mL，4℃度分装保存。

1.5观察指标及方法

1.5.1血生化指标检测747全自动生化分析仪测定血清中的直接胆红素（directbilirubin,D-Bil）,丙氨酸转氨酶（ALT）的含量。

1.5.2血清内毒素（LPS）鲎试剂偶氮基质显色法，测定方法按鲎试剂盒说明书进行（上海伊华临床医学科技公司）。

1.5.3肝细胞内游离钙Fura-2-AM,CaCL2为美国SIGMA公司产品，测定仪器为650-60型日立荧光分光光度计。

1.5.4肝组织病理检查HE染色：观察成纤维细胞增生程度。胶原纤维染色：观察胶原纤维增生情况。网状纤维染色：观察网状纤维增生情况。

1.6统计学分析

所有数据经SPSS10.0统计软件包处理，实验数据以x-±s表示，各组均数间比较用方差分析及q检验。

2结果

2.1血生化指标

血清内毒素（LPS）,肝细胞浆内游离钙含量。II组上述各指标明显升高，与同时相的I组数据相比差异有显著性（P＜0.05）。

III组7d和14d亚组的ALT，LPS及肝细胞浆内游离钙较同时相的II组明显下降，差异有显著性（P＜0.05），见表1。

注：1）II组与同时相的I组比较，P＜0.05

2）II组与同时相的I组比较，P＜0.01

3）III组与同时相的II组比较，P<0.05

4)III组与同时相的II组比较，P<0.01

5）II组组内比较，P<0.05。（均为与3d亚组比较）

表4肝细胞内游离水平的变化（nmol/L，x-±s）

注:1)II组与同时相的I组比较，P<0.05

2）II组与同时相的I组比较，P<0.01

3）III组与同时相的II组比较，P<0.05

4)III组与同时相的II组比较，P<0.01

5）II组组内比较，P<0.01.(均为与3d亚组比较)

2.2肝脏组织病理学观察

2.2.1HE染色I组：肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，无炎性细胞侵润。II组：3d亚组，肝内胆管扩张，偶见肝细胞结构改变，可见少量细胞坏死，表现为细胞浆浓缩，核染色质向核仁或核周边聚集；7d亚组，细胞坏死增加，肝细胞内或细胞间游胆，纤维组织增生，胆小管扩张及中度增生，胆栓形成；14d亚组，细胞坏死达到高峰，大范围的汇管区周围肝细胞变性，纤维组织增生向肝小叶内扩展；III组，3d亚组，肝内胆管扩张，偶见肝细胞结构改变，可见少量细胞坏死，表现为细胞浆浓缩，核染色质向核仁或核周边聚集，7d亚组，与同期的II组相比，病理变化减轻，变性肝细胞数量减少，以脂肪样变为主，纤维组织增生程度轻，为形成假小叶，14d亚组，与同期的II组相比，病理变化明显减轻，变性肝细胞数量明显减少，以脂肪样变为主，纤维组织增生程度减轻，未见假小叶形成。

2.2.2胶原纤维染色Ⅰ组：肝小叶内无胶原纤维存在。Ⅱ组：３ｄ亚组，肝小叶内无胶原纤维存在，７d亚组，可见少量由胶原纤维组成的纤维间隔，14d亚组，肝脏内主要由胶原纤维组成的纤维间隔正在形成或已经形成，其破坏界板、分割、包绕肝小叶，已有假小叶形成。Ⅲ组：３d亚组，肝小叶内无胶原纤维存在，７d亚组，肝内胶原纤维增生程度减轻，未见纤维间隔，14d亚组，肝内胶原纤维增生程度明显减轻，未见假小叶形成。

2.2.3网状纤维染色Ⅰ组：肝小叶内网状纤维支架完整，分布规律。Ⅱ组：３d亚组，肝小叶内网状纤维支架完整，分布规律。7d亚组，汇管区周围网状纤维增生，向小叶内延伸，形成较少的细条索。14d亚组，肝内网状纤维增生程度明显减轻，未见假小叶形成。

3讨论

研究表明[1.2]，阻塞性黄疸（OJ）时肠道细菌移位以G一杆菌为主。而内霉素正是G一杆菌细胞壁上的一种脂多糖，其主要成分是内酯A，它能促进炎症介质的释放，进而加重肝脏损害[3]。本实验显示OJ组血清内毒素含量与假手术组相比明显升高（p<0.05）,证明OJ时确实存在内毒素血症。有研究表明[4.5]内毒素可以刺激阻塞性黄疸大鼠肝脏贮脂细胞（Ito）胶原基因表达增多，并随梗阻时间的延长而进一步增加.Ito是肝脏细胞外基质的主要来源，基质内含有胶原蛋白，OJ时大量沉积于汇管区内和肝小叶内，造成肝脏维化。而肝脏纤维化可引起大量的门-腔静脉短路形成，使流经肝窦的血液减少，造成肝细胞缺血、缺氧。肝纤维化、微循环紊乱使肝细胞“能源危机”加剧，造成钙稳态失衡，进而对肝细胞造成极大损伤。近来研究发现，作为细胞信号传导系统重要的信使-钙离子，在细胞的生长和调控方面起着重要的作用。钙离子在细胞内的生存方式主要有在线粒体，肌质网和质膜上的贮存钙和细胞浆中的游离钙，游离钙不到细胞总钙量的0.1%，并且游离钙和贮存钙之间保持动态的吸收和释放平衡。而细胞内钙稳态的维持，是维系细胞生长发育的正常运转的基础。细胞内游离钙离子水平的持续升高是导致细胞凋亡的重要原因。本实验应用荧光探测技术观察肝细胞浆内游离钙离子额浓度变化，发现OJ组大鼠肝细胞内游离钙离子的浓度与假手术相比，明显增高（P＜0.05）说明ＯＪ时，许多有害因素引起肝细胞浆内游离钙离子的浓度升高，进而启动继发损伤机制。肝细胞浆内游离钙升高的机制可能是：内毒素血症刺激氧自由基产生增多，导致生物膜损伤和ＡＴＰ依赖性钙泵功能不全，使胞浆内钙离子增多。本实验发现OJ7d与14d亚组的多数动物已出现浮水，同时伴有血清内毒素和肝细胞胞浆内游离钙的明显升高，说明内毒素导致钙稳态失衡，与肝损害的发生发展密切相关。本实验未能证明肝复康有降低直接胆红素的作用，说明减黄的根本出路在于胆道引流。肝复康组ALT与OJ组相比明显下降（p<0.01），说明肝复康具有保护肝细胞的功能。

本实验结果表明，在造模同时预防应用肝复康可减轻大鼠的内毒素血症并使肝细胞胞浆内游离钙含量降低，说明肝复康具有抗内毒素血症及钙离子拮抗作用。肝复康由丹参、黄芪、当归等中药配方组成，推测其作用机制可能与活血化瘀，疏肝理气，补脾和补气养血等有关。本实验还发现预防应用肝复康可减轻肝细胞变性、坏死和纤维化的程度。表明肝复康由一定的抗肝纤维化作用。总之，肝复康具有抗内毒素血症，拮抗钙离子，及抗肝纤维化等多重作用，应用于QJ所致肝损害的预防，可体现既治标又治本的双重作用，从而延缓肝损害的进程。有关肝复康的作用机制尚有待进一步探讨。

参考文献

[1]COBBOLDPH,ANDTJ.Fluoresceceandbioluminescecemea-surementofcytoplasmicfreecalcium[J],1987,248:313.

[2]GRAVEJ.GOUMAD.BUURAMNW.Complicationsinob-structivejaundice:roleofendoxins[J].ScandJGastroenteral,1992,194(1):8.

[3]WANGJM,XIAOBL,XULN,etal.Effectoffnctoeonhepatininjuryandexpressionofinosinlinersofobsructinejaundicedrats.ChinaJonrnalofModernMedicine,2006,16(8):1149-1156.

[4]WUWH,YANGYM,HUANGTT.Bilirubinmetabolismafterobstructivejaundiceinrats[J].ChineseJournalofHapatibiliarySurgery,2001,7(5):288.Chinese.

[5]刘金彪，刘观立，张寿熙，等IH764-3对肝脏缺血再灌注损伤的保.