EV71感染患儿外周血淋巴细胞亚群变化的研究

EV71感染患儿外周血淋巴细胞亚群变化的研究

王艳春12杜曾庆1刘梅2王美芬1

王艳春12杜曾庆1刘梅2王美芬1黄永坤2（通讯作者）

(1昆明医科大学附属儿童医院感染科650041；2昆明医科大学第一附属医院儿科650031)

【摘要】目的探讨EV71感染所致手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群的变化及临床意义。方法将88例经粪便RT-PCR试验检测为EV71感染的手足口病患儿分为三组并收集血液标本，普通型24例，重症型21例，危重型43例。采用流式细胞术检测外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD56+T细胞、CD19+T细胞表达。所有数据采用STATA软件进行统计。结果危重型患儿外周血CD3+T细胞比例为50.70±9.42%，重型组患儿外周血CD3+T细胞比例为50.43±10.89%，普通型组患儿外周血CD3+T细胞比例为55.57±9.76%，重型和危重型患儿外周血细胞CD3+T细胞比例较普通型组降低，但差别无显著统计学意义。（P>0.05)。危重型患儿外周血中CD4+T细胞比例为24.87±7.78%，重型组患儿外周血CD4+T细胞比例为25.06±7.87%，普通型患儿外周血CD4+细胞比例30.18±7.18%，危重型组和重型组患儿外周血CD4+T细胞比例较普通型组降低，且随病情加重而减低。三组患儿CD8+、CD56+、CD19+T细胞比例无显著差异（P>0.05)。结论T淋巴细胞减少可能是EV71感染手足口病患儿并发重症和危重症的重要因素之一。

【关键词】肠道病毒71型感染淋巴细胞亚群

【中图分类号】R72【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）04-0059-02

ReaserchonperipheralbloodT-lymphocytessubpopulationinchildrenwithhandfootmouthdiseaseinfectedbyenterovirus71

【Abstract】Objective:ToanalyzethechangesinperipheralbloodT-lymphocytessubpopulationinchildrenwithhandfootmouthdiseaseinfectedbyenterovirus71.Methods:ThebloodsamplesfromChildrenwhoconfirmedinfectedbyenterovirus-71werecollectedandpidedintothreegroups:24patientswithoutcomplications,21patientswithcentralnervoussysteminvolvment,43patientswithautonomicnervoussystemdysregulation(amongthemtwopatientswithPE).ThelevelofCD3+,CD4+,CD8+,CD56+,CD19+andCD4/CD8weredetectedbyflowcytometry(FCM).RESULTS:ThelevelsofCD3+andCD4+inseverecaseswerelowerthanthatinlightcases.TherewerenosignificantdifferenceofCD8+,CD56+,CD19+inthreegroups.Conclusion:TheT-lymphocytedecreaseplayaimportantroleintheformationofseverecases.

【Keywords】Enterovirus71typeInfectionT-lymphocytes

手足口病（Handfootmouthdisease,HFMD)是由20余种肠道病毒感染引起的儿童急性传染病，近年来，该病的发病率在我国呈逐年增高的趋势，且重症病例也日渐增多。EV71是引起重症手足口病的主要病原。T淋巴细胞在机体抗病毒的过程中发挥着重要细胞免疫作用。T淋巴细胞按表达的CD分子不同分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。本研究采用流式细胞仪对EV71感染引起手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群的变化情况进行比较分析。

1资料与方法

1.1一般资料选择2013年2月至2013年7月在昆明市儿童医院住院的肠道病毒71型感染的患儿88例为研究对象。纳入标准：经粪便RT-PCR检测病原为EV71。病程5天内，患儿均符合卫生部《手足口病诊疗指南（2008年版）》《肠道病毒71型感染重症病例临床救治专家共识（2011年版）》重症和危重症标准。30例对照组儿童选自同期到我院行健康体检的儿童。88例Ev71感染的患儿依据有无并发症，单纯并发脑炎，或并发自主神经功能失调（包括肺水肿）分为三组，普通型24例，男8例，平均年龄28.93±21.15月，女8例，平均年龄24±10.51月；重型21例，男12例，平均年龄31.50±13.13月，女9例，平均年龄29.56±11.96月；危重型43例，男24例，平均年龄32.04±21.15月，女19例，平均年龄33.95±14.36月，其中死亡2例：男，1例，年龄1岁9月，女，1例，年龄1岁1月。对照组30例，男21例，平均年龄49±37.72月，女9例，平均年龄41±35.38月。

1.2方法

1.标本收集：每位入组患儿入院当日或次日取静脉血2ml置于肝素抗凝管中。

2.仪器和试剂T淋巴细胞亚群检测试剂盒购自美国BD公司。流式细胞仪CantoⅡ(美国BectonDickinson公司生产）。

3、流式细胞仪检测T细胞亚群：在6个流式检测管中分别加CD45-FITC/CD14-PE，CD3-FITC/CD19-PE，CD3-FITC/CD4-PE，CD3-FITC/CD8-PE，CD3-FITC/CD（16+56）-PE，和阴性对照组(IgG1-FITC/IgG2a-PE)各20ul;每管加入100ul待测外周血样品，室温避光孵育20分钟；每管加入1×溶血素2m;充分振荡混匀，室温避光溶血10分钟；以1000r/min离心10分钟，弃上清；加入约2mlPBS，振荡混匀，以1000rpm离心10分钟，弃上清；加入约500ulPBS缓冲液混匀后上机行流式细胞术检测。应用SimulSET软件进行数据处理。

1.3统计学分析所有数据采用STATA软件进行统计，以X±S表示实验数据。对指标在不同类型中均数是否有差异进行比较时，采用单因素方差分析进行比较，P<0.05视为有统计学意义。进行两两比较时采用Bonferroni法。

2结果

危重型患儿外周血CD3+T细胞比例为50.70±9.42%，重型组患儿外周血CD3+T细胞比例为50.43±10.89%，普通型组患儿外周血CD3+T细胞比例为55.57±9.76%，重型和危重型患儿外周血细胞CD3+T细胞比例较普通型组明显降低，但差别无显著统计学意义。危重型患儿外周血CD4+细胞比例24.87±7.78%，普通型患儿外周血CD4+细胞比例30.18±1.797%，危重型组和重型组患儿外周血CD4+T细胞比例较普通型组降低，且随病情加重而减低。死亡二例患儿外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞比例明显降低。三组患儿CD8+、CD56+、CD19+T细胞比例无显著差异，见表1。

3讨论

EV71为肠道病毒，具有嗜神经性，易侵犯脑干，并发脑干脑炎、神经源性肺水肿、肺出血而严重的威胁患儿的生命健康。而EV71感染后机体的免疫变化一直是一个研究的热点。CD3+分子分布于所有活化T细胞表面。CD4+T淋巴细胞可通过活化巨噬细胞及释放多种细胞因子而清除宿主胞内的病原体。CD8+T细胞主要杀伤胞内寄生病原体的宿主细胞。正常人体的免疫状态是在多种细胞及细胞因子的相互作用下保持平衡。一旦平衡被打破，可能出现免疫功能紊乱，致病微生物乘虚而入，病情向重症进展。

Wang等[3]研究不同的EV71感染患者（无明显症状者、CNSD、PE），结果发现随着病情的加重，淋巴细胞增殖指数以及CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞不断降低。付丹等[4]将EV71感染患儿依据病情的轻重分为HFMD、CNSD、CNSD伴自主神经功能失调（ANSD）及PE四组，观察EV71感染患儿免疫功能变化。结果发现，随着病情的加重，外周血淋巴细胞绝对计数明显减少，CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞不断降低。Chen等[5]的初步研究表明，EV71能直接感染淋巴细胞，并诱导其凋亡。

在本研究中通过对比普通型、重型、危重型手足口病患儿外周血T淋巴细胞亚群变化发现随着病情的加重CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞比例降低，尤其是死亡两例患儿CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞比例明显降低，提示EV71感染HFMD患儿体内活化的T淋巴细胞比例降低，免疫功能低，使得病毒有入侵和发病的机会[12]。细胞免疫在手足口病的进展中有重要的作用。本研究显示各组间CD56+表达无显著性差异，原因可能是在APC通过胞膜接触和分泌细胞因子途径上调NK细胞活性[14]。CD19+是全部B细胞共有的表面标志，B细胞活化后也不消失，是B细胞抗原受体（BCR）共同体复合物成员之一，参与B细胞活化。受病毒感染后，机体会发生类似变态反应的免疫学变化，初次接触病毒时体内B细胞开始活化，胞内发生一系列分子生物学变化，如蛋白质和核酸合成增加，再次受到刺激上述B细胞开始分裂病分泌大量免疫球蛋白样抗体，发挥体液免疫功能。本研究三组患儿CD19+表达无显著性差异。

目前手足口病治疗中尚无特效药，也没有有效的疫苗，因此在临床工作中可通过检测外周血T淋巴细胞比例，早期预测重症病例，及时干预，适时应用免疫调节剂，提高救治水平。

本研究不足之处在于样本量较小，在将来的研究工作中加大各组的样本量，以取得更加可靠的数据。

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表1：三组患儿外周血淋巴细胞亚群检测结果（%，x±s)