小白菊内酯对Jurkat细胞增殖和凋亡作用

小白菊内酯对Jurkat细胞增殖和凋亡作用

刘玲王晓桃刘健唐爱林聂宇薇

刘玲王晓桃刘健唐爱林聂宇薇

(桂林医学院附属医院广西桂林541001)

【摘要】目的:研究小白菊内酯(parthenolide,PTL)对Jurkat细胞增殖抑制及凋亡的作用及其机制。方法:以Jurkat细胞为靶细胞,四氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞24h,48h,72h的增殖活性,应用AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测药物作用后Jurkat细胞的凋亡率，应用免疫组化法检测药物作用后Jurkat细胞NF-κBp65蛋白的变化。结果:5-20μmol/LPTL可以明显抑制细胞增殖，对细胞增殖的抑制作用随PTL浓度增加和作用时间延长而逐渐增强(r=0.837,P＜0.01)，PTL的24,48,72h的IC50分别为4.71±1.32、8.11±1.96、11.4±1.54umol/L(P均<0.01)。0、5、10umol/LPTL处理48h,Jurkat细胞的凋亡率分别为4.2±1.23%、10.5±2.03%、22.1±2.28%,(p<0.01),有统计学意义。0、5、10umol/LPTL作用于Jurkat细胞24h后的NF-κBp65的表达率和阳性积分均存在统计差异(p<0.01)。结论:PTL可通过抑制NF-κBp65信号通路，抑制Jurkat细胞的增殖活性,并呈明显的浓度依赖性，并诱导其凋亡。本研究结果为临床应用小白菊内酯治疗急性淋巴细胞白血病提供了实验依据。

【关键词】Jurkat细胞小白菊内酯增殖凋亡NF-κB/p65

【中图分类号】R55【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）15-0280-02

本研究以人T-ALL细胞株Jurkat为研究对象，探讨抗白血病的效应，并通过检测核因子κB(factor-kappaB,NF-κB)/p65的活性来探讨其可能的机制，有可能为T-ALL的临床治疗提供一种耐受性高、副作用小的新联合治疗方案。

材料与方法

1.细胞及试剂来源人T-ALL细胞株Jurkat(天津血液病研究所)，小白菊内酯(分子式C15H2003，分子量248.32，成都普瑞法生物科技有限公司)RPMI-Medium1640干粉、胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、DMSO溶液(北京SABC公司产品)；鼠抗人单克隆抗体(浓缩型)NF-κBp65(北京中山公司)，二抗快捷性酶标为羊抗鼠/兔IgG聚合物(福建迈新生物技术开发有限公司)，荧光抗体(美国SantaCruz公司)。6孔、96孔培养板(美国Corning公司)；AnnexinVFITC/PI细胞凋亡测定试剂盒(购自美国BD公司)；自动酶标读数仪(国产DG-3022)；流式细胞仪(美国BD公司)。

2.细胞传代培养人T-ALL细胞株Jurkat从外室引进后，常规离心弃上清，复苏后的细胞在含体积分数10%的加热灭活的胎牛血清(10%FBS)及100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640的培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2孵箱中培养，每2-3天更换培养基并传代一次。本实验用的细胞均处于对数生长期。

3.MTT法计算PTL的各药物浓度对Jurkat细胞的半数抑制浓度(50%inhibitoryconcentriton,IC50)和增殖抑制率(inhibtionrate)取Jurkat细胞株100ul加入96孔平底培养板中，加入不同浓度的PTL(使其终浓度为1、2.5、5、10、20、40μmol/L)，使细胞浓度为5×105/ml，每孔最终体积为200μL，每组重复5孔，置37℃、5%CO2培养箱培养48h后，在终止培养前4h，每孔轻轻吸去上清，用PBS洗涤后再次离心，弃上清，加入150ulRPMI1640培养液，再加入20ul0.5%MTT溶液(5mg/ml)，继续放置CO2培养箱培养4h后，放入离心机中800rpm离心5min，弃上清液，加150μL/孔DMSO终止培养，轻轻震荡5min，使结晶溶解。置酶联免疫检测仪下测490nm吸光度值(A)，同时设置调零孔，对照孔。细胞增殖抑制率％=[(对照孔A值－实验孔A值)/对照孔A值]×100%。用直线回归法计算IC50值。实验重复3次。

4.AnnexinVFITC/PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡率实验分组：溶剂对照组(分别为均含Jurkat细胞的空白对照组、AnnexinV、PI、及AnnexinV和PI两种试剂均有的四组)，PTL组(含PTL5、10μmol／L)。将人Jurkat细胞株置于10％FCS培养基中在6孔板中培养过夜，调节细胞密度至1×106/ml，体积2ml,按实验分组再在培养液中共同培育48h后，进行实验操作，最后利用CellQuest功能软件获取参数、数据分析。本实验重复3次。

5.免疫组化检测NF-κBp65蛋白水平的变化实验分组：5、10μmol/L。按常规免疫组化法进行操作，每一批实验均设有阳性及空白对照。

6.统计学方法数据均用SPSS1,6.0统计软件进行数据分析，参数检验的计量资料以x-±s表示，多组间差异的比较采用单因素方差分析，直线回归法计算IC50值；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

本研究证明了PTL可以通过降低NF-κB信号通路的表达，抑制Jurkat细胞的增殖活性,呈明显的浓度依赖性，并诱导其凋亡，对于T-ALL的药物治疗、防止耐药有着重要的临床意义。有关PTL对白血病干细胞的直接作用及其分子机制,有待进行深入的研究。

参考文献

[1]易娟,陈静等小白菊内酯对白血病K562细胞及其干细胞的作用[J].中国中药杂志，2010，2(35)：219-222.