血清蛋白质组学研究中乙腈-异丙醇沉淀法结合2DLC-MS/MS的应用

血清蛋白质组学研究中乙腈-异丙醇沉淀法结合2DLC-MS/MS的应用

吴勇浒韩冉冉黄元姣

吴勇浒韩冉冉黄元姣（通讯作者）（广西医科大学/医学科学实验中心广西南宁530014）

【摘要】目的探讨血清蛋白质组学研究中高丰度大分子蛋白质的去除方法及其效果。方法利用不同浓度的乙腈-异丙醇处理血清，采用凝胶电泳和二维液相结合MAILDTOF/TOF-MS鉴定蛋白。结果乙腈-异丙醇沉淀可去除血清中绝大大部分高丰度大分子蛋白质，但蛋白质和多肽丢失失较多，初步的质谱鉴定得出26种蛋白。结论乙腈-异丙醇处理血清有可能为血清蛋白质组学提供简单有效的分析某些蛋白的方法。

【关键词】乙腈异丙醇血清2DLC-MS/MS

【中图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）11-0024-02

由于疾病发生和发展过程中患者血清含有表达异常的蛋白质使血清成为研究疾病生物标志的一个重要对象，通过质谱全面动态的分析这些差异蛋白有助于发现与疾病诊断及预后相关的生物标志物及潜在的治疗靶点。蛋白组学的一个重大挑战就是要在像血清、血浆等高度复杂和大动态范围的样品中准确定量蛋白，而潜在的新的标志物极可能是低丰度蛋白或多肽。另外血液组份易受各种因素影响导致个体间差异较大，但目前欠缺简单有效的方法去除高丰度大分子蛋白的干扰，使得比较蛋白组学研究样本难以标准化[1]。本文利用不同浓度的乙腈-异丙醇沉淀处理血清、Tricine-SDS-PAGE和MAILDTOF/TOF-MS分析处理结果，探讨血清蛋白质组研究中高丰度蛋白质的去除方法，为研究血清蛋白质组和获得疾病相关的血清蛋白标志物打下基础。

1材料与方法

1.1材料

血清由正常人血液获得。实验所用试剂如乙腈、异丙醇、甲醇、乙醇等为HPLC级，购自Merck公司。NuPAGEBis-Tris凝胶购自life公司，强阳离子交换柱(strongcationexchangecolumn,SCX)购自PolyLC公司；MagicC18AQ液相色谱柱购自Michrom公司；Nano-drop2000点靶仪购自Thermoscientific公司；C18spincolumn除盐柱购自TheNestGroup公司；5800PlusMALDI-TOF/TOF质谱仪和ProteinPilot4.0软件购自ABSciex公司。

1.2方法

1.2.1样本处理将4℃保存的血清5000g离心10min，10例血清各取200μl混合均匀作为实验样本。

1.2.2去除高丰度蛋白取200ul混合血清与不同比例乙腈或乙腈-异丙醇混合液颠倒混合均匀，冰上静置10min，10000g/min离心10min，取上清。使用旋转真空浓缩仪4oC20min以去除大部分有机溶剂。

1.2.3脱盐及蛋白浓度测定使用Millipore3000MWCO超滤管，经3次50mMTEABbuffer洗脱浓缩至约200μl体积。BCA试剂盒(Pierce)测定蛋白浓度，分装成每管100μg蛋白，冷冻干燥。

1.2.4Tricine-SDS-PAGE电泳实验方法参照邓等[2]所述，通过考马斯R250染色结果比较各个比例的处理效果。

1.2.5NuPAGEBis-Tris凝胶电泳实验操作按照制造商说明书进行，电泳条件180V35min。

1.2.6蛋白酶解冻干的100μg蛋白样本加入20ul1MTEABbuffer充分复溶，SDS变性、TCEP还原、MTTS封闭后加入5μg胰酶（Promega）37℃消化14h，冷冻干燥。

1.2.7离线二维液相色谱分离与点靶酶解后样品用2mlSCXbufferA(10mMKH2PO4，20%CAN，PH2.7)复溶，上样到SCX柱上，经SCXbufferB(bufferA+1MKCl)梯度洗脱（30min0→15%，5min15→30%，5min30→100%，10min100%），收集成2个馏分，冻干。馏分用20～40ul0.1%TFA复溶，进行反相C18柱梯度淋洗和点靶。

1.2.8质谱分析使用5800PlusMALDI-TOF/TOF质谱仪进行，质谱数据采ProteinPilot4.0软件对Uniprot数据库进行检索以鉴定蛋白，以通过5%FDR(FalseDiscoveryRates)验证、UnusedScore>1.3且至少有1个95%置信肽段为鉴定标准[3]。

2结果

乙腈处理血清后仍存才大量的高丰度蛋白（图1A），且处理效果的稳定性较差，多次试验之间去除效果存在差异。相对于乙腈-甲醇、乙腈-乙醇、乙腈-异戊醇，乙腈-异丙醇拥有最好的处理血清效果，大部分高丰度大分子蛋白得到去除（图1B）。乙腈-异丙醇处理效果稳定，在一定范围内改变乙腈-异丙醇的比例和血清-（乙腈-异丙醇）的比例对于处理效果无明显影响（图2A、B）。通过对各个混合比例的实验比较，确定血清与有机溶剂(乙腈：异丙醇，35:1)在1:1.25比例时拥有较好的去除效果。

按照以上实验确定的比例处理血清制备蛋白样品进行质谱实验。质谱鉴定的蛋白信息见表1，质谱鉴定结果显示共有26个符合鉴定标准的蛋白，17个蛋白小于45KDa其中8个小于15KDa（图2）。

图1.Tricine-SDS-PAGE电泳结果。A：不同批次乙腈处理血清实验的结果。B：不同的醇与乙腈按1:30混合后处理血清的效果（图中a乙腈ACN，b甲醇MeOH、c乙醇ethanol、d异丙醇isopropanol、e异戊醇isoamylol）。

图2.NuPAGEBis-Tris凝胶电泳结果。A：不同异丙醇-乙腈混合比例处理血清的效果（S普通未处理血清serum；异丙醇：乙腈1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35。B：不同血清与有溶剂（异丙醇：乙腈=1：35）比例处理血清的效果（1:1.4、1:1.35、1:1.3、1:1.25、1:1.2、1:1.15、1:1.1）；（S普通未处理血清serum，A经AgilentHuman14亲和去除柱去除高丰度蛋白的血清样品。

表1乙腈-异丙醇处理后的血清质谱鉴定信息

*ITIH2:Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH2。

3讨论

血清中种类较少的高丰度蛋白极大地干扰了对种类复杂的低丰度蛋白和较小相对分子量蛋白的检测，而后者很可能存在一些信号转导和调控的关键蛋白，如用于肿瘤早期诊断的生物学标志物大部分为低丰度表达的蛋白。目前已经建立了多种去除高丰度蛋白质方法并在蛋白组学实验组中得到运用，如有机溶剂沉淀法和亲和色谱分离法。但这些方法都是为了在去除高丰度蛋白同时尽可能保留低丰度蛋白以为蛋白组学实验服务，导致过程复杂、耗时、重复性较低或者费用高昂，而且仍保留有相当部分高丰度蛋白，从而导致这些实验方法难以直接转化实际运用。

乙腈是血清研究中常用的有机溶剂，它可以破坏蛋白间相互作用。血清中的多种大分子高丰度蛋白，像α2巨球蛋白，可以结合或者吸附许多低丰度小分子蛋白，通过乙腈处理可以使小分子蛋白解离开从而提高对低丰度蛋白的检测灵敏度。但乙腈处理血清效果仍不理想，大量的高丰度蛋白仍然存在，而异丙醇可以改变蛋白的表面性质使蛋白更易聚集沉淀，本研究采用的乙腈-异丙醇处理血清方法简单，重复性好。由于技术限制，在去除高丰度蛋白的同时损失了相当多的低丰度蛋白，质谱只鉴定到26种蛋白。虽然本实验液相分离肽段时只分成2个馏分，更精细的分离将可能使得质谱鉴定的蛋白数量提高，但可预期的数量并不会太多。本实验旨在获得针对某些蛋白的简单有效排除高丰度蛋白干扰的方法，蛋白的大量丢失也可以接受。

载脂蛋白系列与脂类代谢密切相关，大量的研究证实其与糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病如动脉粥样硬化和阿尔茨海默相关[4]。另外，在多种癌症或肿瘤中，特别是在肝、胰、肠等与代谢相关组织肿瘤，发现载脂蛋白表达水平发生改变，表明载脂蛋白参与肿瘤进程。鉴定出的蛋白中有6个载脂蛋白，表明本实验方法可能对于载脂蛋白有较好的处理效果，乙腈-异丙醇处理血清有可能为血清蛋白质组学提供简单有效的分析某些蛋白的方法。

参考文献

[1]DiamandisEP.Massspectrometryasadiagnosticandacancerbiomarkerdiscoverytool:opportunitiesandpotentiallimitations[J].MolCellProteomics，2004,3(4):367-378.

[2]黄元姣,邓开凤.鼻咽癌血清蛋白质组学研究中乙腈沉淀法的应用[J].华南国防医学杂志，2011,25(6):469-472.

[3]RichardDUnwin1,JohnRGriffiths,AnthonyDWhetton.SimultaneousanalysisofrelativeproteinexpressionlevelsacrossmultiplesamplesusingiTRAQisobarictagswith2DnanoLC–MS/MS[J].NatureProtocols，2010,1574-1582.

[4]VanitallieTB.PreclinicalsporadicAlzheimer'sdisease:targetforpersonalizeddiagnosisandpreventiveintervention[J].Metabolism，2013,62(1):S30-33.

基金项目：本研究受广西自然科学基金（2011GXNSFA018233）项目资助。