人血清中去甲万古霉素浓度HPLC法的建立

人血清中去甲万古霉素浓度HPLC法的建立

王正雨

江苏省淮安市第二人民医院（223002）

【摘要】目的：建立人血清中去甲万古霉素浓度的HPLC测定方法。方法：色谱柱为Nova-PakC18（3.9×150mm，5μm）柱；流动相为磷酸二氢钾缓冲液（pH=3.2）-甲醇（86：14），流速1mL/min；检测波长236nm；采用三氯乙酸直接沉淀蛋白后进样。结果：去甲万古霉素血药浓度与峰面积线性关系良好。日内精密度RSD小于3.1%，日间精密度RSD小于3.8%；高、中、低浓度的平均方法回收率分别为99.2%，98.88%，99.28%。结论：操作简便快速，回收率稳定，适于临床血药浓度测定。

【关键词】：高效液相色谱法；去甲万古霉素；血药浓度

去甲万古霉素又称抗耐药菌类抗生素，但有耳、肾不良反应，常需进行血药浓度监测，一般采用荧光偏振免疫法，但精密度不高，需建立更适宜的色谱条件，提高准确性。

1.仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪；空白血清；去甲万古霉素标准品；甲醇（色谱纯）；蒸馏水经重蒸馏处理。

2.方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Nova-PakC18（3.9mm×150mm，5μm）柱；流动相为磷酸二氢钾缓冲液（0.05mmol/L，磷酸调pH3.2）-甲醇（86：14），用前经0.45μm滤膜过滤，流速1mL/min；紫外检测波长236nm；柱温35℃，进样体积10μL。

2.2溶液的配制

去甲万古霉素标准储备液的配制：去甲万古霉素样品40.1mg置50mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配制成浓度为400μg/mL的标准储备液100mL，置冰箱4℃保存备用。临用时用蒸馏水稀释成浓度分别为2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0mg/L的标准液，以及浓度分别为5.0，40.0，80.0mg/L的质控液。

磷酸盐缓冲液的配制：KH2PO46.8045g置1000mL量筒中，加蒸馏水至1000mL，搅拌、溶解，然后用pH计调溶液pH值为3.2，即得。

2.3样品处理

取血清300μL于具塞离心管中，加入10%三氯乙酸30μL，漩涡振荡30s后，14000r﹒min-1离心10min，取上清液200μL于另一离心管，加入10%氢氧化钠溶液100μL，漩涡混匀10s后，取10μL自动进样。

2.4色谱分离情况

取空白血清，按2.3项下处理，进样分析；另将去甲万古霉素标准液加入空白血清，同法处理，进样分析，去甲万古霉素样品色谱图，见图1，去甲万古霉素基线分离且峰形良好，保留时间约为5.8min。结果表明，空白血清中未见杂质峰干扰去甲万古霉素的测定。

图1空白血清（a）和去甲万古霉素血清样品（b）色谱图

2.5线性关系考察

取空白血清0.5mL，分别加入去甲万古霉素标准储备液（400μg/mL）5，12.5，25，50，125，250μL，按3.3项下处理，得浓度分别为2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0μg/mL去甲万古霉素血清对照品溶液，进样分析，得去甲万古霉素相应的峰面积依次为11.75，29.01，57.32，110.64，270.58，526.27μv·s。以血药浓度（X）为横坐标，去甲万古霉素样品峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。得去甲万古霉素回归方程为Y=5.2453X+4.1175，r=0.9999，在2.0～100.0μg/mL范围内线性关系良好。

2.6方法精密度试验

取去甲万古霉素标准储备液（400μg/mL）12.5，100，200μL，依次加入空白血清至1mL，按2.3项下处理。高、中、低浓度日内平行测定5次，计算日内精密度；每日测定一次，连续测定3d，计算日间精密度。结果见表1，符合生物样品分析要求。

3.讨论

本试验采用HPLC法测定去甲万古霉素的血药浓度，操作简便、快速、准确，且回收率稳定。流动相PH值对去甲万古霉素的出峰时间以及峰型均有影响[1]，故此选择了pH=3.2的磷酸二氢钾缓冲液与甲醇配比（86：14）作为流动相，试验证明按此配比的流动相可很好的将去甲万古霉素与杂质分离，且峰形良好。在血样处理方法上，有文献报道以（ZnSO4）为沉淀剂沉淀血清蛋白后直接进柱分析[3]，但沉淀后液体不适于直接进柱测定。本试验采用三氯乙酸为沉淀剂，在样品中加入氢氧化钠中和三氯乙酸处理后的酸性，可有效抑制去甲万古霉素的降解。

参考文献:

[1].涂厉标，王真，李旭梅.高效液相色谱法测定血清去甲万古霉素与万古霉素的浓度[J].医药导报，2007，27（5）：485-487．

第一作者：王正雨，男，43岁，副主任药师。专业方向：临床药学