熊胆系珍贵药材,有清热解毒,止痛,明目之功效,临床用于治疗肝热炽盛,热极生风所致的惊风,抽搐,肝热,目赤肿痛,以及用于疮痈肿痛等症。有关熊胆及熊胆粉中氨基酸含有的种类及含量未见报道,本文收集了国内熊胆及熊胆粉的主要产区黑龙江,四川的样品,并进行了分析测定。
1仪器与试药
WatersPICO.TAGTM操作台;氨基酸专用柱(15cm×4mmI.D);490多功能检测器;680梯度控制器;WatersPTTC衍生化试剂;三乙胺;乙腈乙酸钠均为分析纯。
2实验方法
2.1溶液的配制(1)标准品溶液:取标准品氨基酸,用0.1mol/L盐酸水溶液配制成2.5μmol/L备用。(2)供试品溶液:精密称取熊胆粉约30mg,置5ml量瓶中,加水溶解、备用。(3)衍生化反应试液:取无水乙醇140μl,三乙胺20μl,PTTC20μl,水20μl,混合均匀,备用。(4)再干燥用溶液:取无水乙醇20μl,水20μl,三乙胺10μl,混合均匀,备用。(5)试样稀释用缓冲液:取710mg磷酸氢二钠加1000ml水,用10%磷酸-乙腈(95:5)调至PH7.4,备用。
2.2水解取100μl上述供试品溶液,置样品小管中,将样品小管置反应瓶中,盖上瓶盖,真空抽干,在反应瓶中加入含1%酚的6mol/L盐酸200μl,抽至真空,置115℃水解24h。
2.3衍生化(1)取标准品溶液5μl,真空抽干,加20L衍生化反应试液,搅拌均匀,放置30min,抽干。(2)取出水解后的样品小管,擦掉小管外面的盐酸,抽干,加入10μl再干燥用溶液,搅拌均匀,抽干,将样品小管取出,加入20μl衍生化反应试验,搅拌均匀,放置30min,抽干。
3结果
分别在标准品及样品小管中加入100μl试样稀释用缓冲液,取10μl进行HPLC测定。
4讨论
4.1熊胆供试品溶液采用水,甲醇对比试验,结果暴水溶液比甲醇溶液中的氨基酸含量高,因此选择水为溶媒。
4.2水解氨基酸,酸水解和碱水解,测定结果一致,因碱水
4.3熊胆与熊胆粉均分离出17种氨基酸,说明氨基酸种类一致,但含量不同,熊胆粉略高于熊胆。
4.4四川熊胆与黑龙江熊胆其氨基酸种类及含量均无明显差别。