注射用头孢他啶中的有关物质测定方法学研究

注射用头孢他啶中的有关物质测定方法学研究

吴蔚1胡咏华2

长沙市第一医院湖南长沙410013

摘要：目的建立注射用头孢他啶有关物质的高效液相色谱测定方法。方法以diamonsilC18（4.6mm×150mm，5μm）为色谱柱，以乙腈流动相A，0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=3.9）为流动相B；梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长为255nm。结果头孢他啶在0.971～14.565μg/ml浓度范围内，色谱峰面积与浓度呈现良好的线性关系，R²=0.9998，最低检出量为1.0072ng，头孢他啶主峰与各杂质峰分离度好。结论本法用于测定注射用头孢他啶中有关物质的含量，简便、快速，结果准确。

关键词：高效液相法；头孢他啶；有关物质

AbstractObjective：TodevelopaHPLCmethodforthedeterminationoftherelatedsubstancesinceftazidimeforInjection.Method：TheseparationwascarriedoutonadiamonsilC18（4.6mm×150mm，5μm）columnwithAcetonitrileasmobilephaseA，and0.02mol/Lphosphatebuffersolution（pH=3.9）asmobilephaseB.Theflowratewas1.0ml/min，andcolumntemperaturewas35℃.Thedetectionwavelengthwas255nm.Result：Therewasagoodlinearrelationshipbetweenthepeakareavalueandtheconcentrationofceftazidimewithinrangeof0.971~14.565μg/ml（correlationcoefficient=0.9998），thelimitoflowdetectionwas1.0072ng.Conclusion：Thismethodwassimple，rapid，andaccuratefordeterminationofrelatedsubstancesinceftazidimeforinjection.

Keywords：HPLC；Ceftazidime；Relatedsubstances.

前言

注射用头孢他啶是半合成的第三代头孢菌素类抗生素，属于β-内酰胺类抗生素，临床上主要用于菌血症、败血症、脑膜炎等危重感染。该制剂的有关物质检测方法仅在Eur.P增补版中有收载[1]。由于头孢他啶分子结构中含有β-内酰胺环，性质不稳定，遇光、热易产生降解产物，合成时也可能引入原料、中间体、副产物等杂质，且β-内酰胺类抗生素药物杂质的来源往往和生产工艺有关，不同的生产工艺将会产生不同的有害杂质。因此，对头孢他啶的杂质进行定性定量分析，成为提高其产品质量的关键问题之一[2]。中国药典2010年版二部[3]已收藏其质量标准，含量测定采用HPLC法，色谱条件中水相比例比较高，峰形不理想。本文仍采用HPLC法，流动相成分进行略微的改变，将甲醇换成了乙腈，并采用梯度洗脱的方法，可得到理想峰形。

本文建立了高效液相色谱法测定注射用头孢他啶有关物质的方法，方法学考察验证和测定结果表明，本法能使头孢他啶主峰和其杂质峰得到满意的分离，所建立的方法操作快速、简便[4]。

1仪器与试药

Waters-e2695-2998高效液相色谱仪，PDA检测器。

头孢他啶对照品（批号：130484-201003，含量：84.8%），注射用头孢他啶（批号：20101001、20101101、20101201），由海南中化联合制药工业有限公司提供。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：diamonsilC18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：A为乙腈，B为磷酸盐缓冲溶液（取磷酸二氢铵22.6g加水溶解并稀释至1000ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至3.9）；检测波长：255nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；线性梯度洗脱，如表1。

2.4酸、碱、氧化、热及光破坏性试验

为加速本品降解产物的产生，了解其降解产物的情况，取本品分别进行酸、碱、热、光、氧化等破坏性试验，考察样品有关物质的变化情况。

2.4.1碱破坏试验

取本品75mg，加入1mol/L的氢氧化钠溶液2ml，放置0.5小时，用酸中和后，加流动相A（乙腈）稀释至50ml，滤过，取续滤液10µl注入液相色谱仪。试验结果表明样品经过碱破坏之后杂质峰明显有增多，说明该药品在碱性条件下不稳定。

2.4.2酸破坏试验

取本品75mg，加入1mol/L的盐酸溶液2ml，放置2小时，用碱中和后，加流动相A（乙腈）稀释至50ml，滤过，取续滤液进样10µl注入液相色谱仪。试验结果表明样品经过酸破坏之后杂质峰无增多，说明该药品在酸性条件下稳定。

2.4.3氧化破坏试验

取本品75mg，加入30％过氧化氢溶液2ml，放置1小时，加流动相A（乙腈）稀释至50ml，滤过，取续滤液进样10µl注入液相色谱仪。试验结果表明样品经过氧化破坏之后杂质峰明显有增多，说明该药品在氧化条件下不稳定。

2.4.4热破坏试验

取本品75mg，置70℃水浴放置1小时，加流动相A（乙腈）稀释至50ml，滤过，取续滤液进样10µl注入液相色谱仪。结果表明样品经过热破坏之后杂质峰明显有增多，说明该药品在热性条件下不稳定。

2.4.5光破坏试验

取本品75mg，置4000lx光照72小时，加流动相A（乙腈）稀释至50ml，滤过，取续滤液进样10µl注入液相色谱仪。结果表明样品经过光破坏之后杂质峰明显有增多，说明该药品在光性条件下不稳定。

试验结果表明：本品经酸、碱、氧化、热、光破坏后，产生的杂质峰均能与主峰分离，说明该色谱系统能有效检测降解产物。

2.5最低检测限

取头孢他啶对照品50.36mg，加流动相A稀释500000倍，制成每1ml中含100.72ng的溶液，取10μl注入液相色谱仪，计算。本品的检测限（S/N为3）为1.0072ng。

2.6最低定量限

取头孢他啶对照品50.36mg，加流动相A稀释50000倍，制成每1ml中含1.0072μg的溶液，取10μl注入液相色谱仪，计算。本品的定量限（S/N为10）为10.075ng。

2.7线性关系考察

取头孢他啶对照品48.55mg，置50ml量瓶中，乙腈稀释至刻度，精密量取1.0ml至100ml量瓶中，用流动相A-流动相B（7：93）稀释至刻度，摇匀，分别取2μl、6μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl注入液相色谱仪，以进样量为X轴，峰面积为Y轴，进行线性回归，回归方程为：y=1594.0X+3089.6，R²=0.9998。试验结果表明：头孢他啶的浓度在0.971～14.565μg/ml的范围内，峰面积与浓度呈现良好的线性关系。

2.8辅料干扰试验

注射用头孢他啶中加入了适量精氨酸做助溶剂制成，所以需要考察精氨酸对有关物质测定的影响。因此按厂家提供的处方比例精密称取精氨酸配成1mg/ml的溶液，然后精密量取15ml置100ml量瓶中，用流动相充分振摇溶解后稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液，照2.2色谱条件进行检测。结果无色谱峰出现，说明辅料不干扰测定。

2.9耐用性试验

分别采用以下三种牌号的色谱柱，取2.4.2中溶液10μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱柱分别为：ThermoC18柱（250×4.6mm，5µm）、DiamonsilC18柱（250×4.6mm，5µm）、m）、PhenomeC18柱（200mm×4.6mm，5µm）。试验结果表明：各色谱峰之间的分离度符合规定。以上测定条件有微小变动时，该方法基本不受影响，耐用性良好。

2.10样品测定

分别取注射用头孢他啶三批（批号：20101001、20101101、20101201），精密称定，用流动相A溶解并稀释成每1ml约含头孢他啶1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取对照品溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈-磷酸盐缓冲溶液（取磷酸二氢铵22.6g，加水溶解并稀释至1000ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至3.9）（7：93）稀释至刻度，作为对照溶液。精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表2。

结果表明：三批供试品及对照样品最大杂质均小于0.3%，总杂质均小于1.0%。

3讨论

本试验相比较其他文献报道的方法进样量小，灵敏度更高，最低检测限和最低定量限均低于已有方法[4-5]。对试验所用的流动相进行了三个pH的试验，分别以磷酸调节盐溶液至pH7.0、pH3.9和pH3.0结果发现以磷酸调节盐溶液的pH值至3.9（以提高流动相的酸性，抑制头孢他啶的离子化程度）时头孢他啶的理论塔板数为11030，柱效良好，3min以后各杂质峰的分离度大于1.5，主峰与相邻杂质峰的分离度大于2.0，符合《中国药典》的有关要求。因此，选定本品的流动相为磷酸二氢铵溶液（10%磷酸调节pH值至3.9）-乙腈（93：7）。

参考文献：

[1]EuropeanPharmacopoeia3rdEdition2000supplement.2010：510.

[2]欧贝丽，姜力群，章宇，曲斌，施月琴，陈德英，胡育筑.β-内酰胺类抗生素药物的杂质分析及其质量研究[J].分析实验室，2011，10（26）：166-167.

[3]中国药典2010年版.二部[S].2010：176.

[4]石瑛，牛彦，吴美红.高效液相色谱法测定注射用头孢他啶有关物质[J]广东药学，2011.11（6）：21-22.

[5]张冬，郭毅，孙卫，韩国将.注射用头孢他啶的有关物质测定[J].药物鉴定，2012.17（13）：34-36.