还少丹对老年大鼠肝细胞老化改变的影响

还少丹对老年大鼠肝细胞老化改变的影响

崔姣

湖南中医药大学第二附属医院湖南长沙410005

【摘要】目的：探讨还少丹对老年大鼠肝细胞老化改变的影响。方法：以24只健康SD老年大鼠为研究对象，用还少丹水煎液给药物组老年大鼠灌胃，用等量生理盐水给对照组大鼠灌胃，80d后断头处死大鼠，取鼠肝提取DNA，用碱变性法检测鼠肝DNA增色效应；用硫代巴比妥酸（ThibabituricAcidTBA）法和荧光光度法分别测定鼠肝丙二醛（malondialdehydeMDA）和脂褐素（lipofuseinLF）含量。结果：还少丹能显著降低鼠肝碱变性增色效应（P<0.01）；并能降低鼠肝丙二醛和脂褐素的含量，结果均具有显著性差异（P<0.01）。结论：①鼠肝DNA碱变性增色效应、丙二醛和脂褐素含量的改变，反应了肝细胞的老化过程。②还少丹具有拮抗鼠肝衰老的作用。

【关键词】抗衰老；碱变性；增色效应；丙二醛；脂褐素

EFFECTSOFHUANSHAOONAGINGCHANGEINAGINGRATS’LIVERCELLS

Cui-jiao

ThesecondaffiliatedhospitalofhunanuniversityofTCM，HunanChangsha，410005

Abstractobjective：ToexploretheeffectsofHuanshaodanonagingchangeinagingrats’livercells.METHODS：Twenty-fourhealthySDagingratswereused.ThetreatmentgroupreceivedgastricperfusionofHuanshaodandecoction；thoseinthecontrolgroupweretreatedwithgastricperfusionofsalineofthesamevolume，for80days.TheheadsofratswerecutdownforDNAobtainedfromtherats’liver.ThehyperchromiceffectsofDNAinthelivercellofoldratsweredetectedwithalkalisdenaturationmethod.Thecontentsofmalondialdehydeandlipofuscinintheliverofoldratsweredetectedwiththibabituricacidandfluorospectrophometeranalysismethods.

RESULTS：HuanshaodancouldnotonlyremarkablydecreasethehyperchromiceffectofalkalisdenaturedDNAintheliverofoldrats（P<0.01），butalsoremarkablydecreasethecontentsofmalondialdehyde（P<0.01）andlipofusein（P<0.01）intheliverofoldrats.CONCLUSIONS：①ThechangesofthehyperchromiceffectofalkalisdenaturedDNAandthecontentsofmalondialdehydeandlipofuscinintheoldrats’liver，reflectedtheprocessofaginginlivercell．Huanshaodanhasthefunctionofanti-agingintheliverofoldrats.

Keyword：anti-aging；alkalisdenatured；hyperchromiceffect；maloudialdehyde；lipofuscin

随着年龄的增长，肝染色体DNA损伤增加，细胞的氧化损害增加，生物大分子交联反应增多[1]。如果这些损伤不能及时修复就会阻碍肝细胞的正常代谢与功能，造成细胞的

1材料与方法

1.1实验动物与仪器药品：健康SD老年大鼠，21月龄，由湖南农业大学实验动物中心提供，雌雄各半，雄性大鼠体重（643.74±61.04）g，雌性大鼠体重（505.32±60.31）g。还少丹水煎液，由何首乌、熟地、肉苁蓉等中药组成（购自湖南省药材公司）。丙二醛和脂褐素测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。F-4500荧光光度计日本HITACHI公司产品；UV-9200紫外分光光度计和VIS-7220可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司产品。

1.2还少丹提取物的制备：将310g中药加水800ml，煎煮1h，离心过滤；滤渣再加水煎煮1h，离心过滤；合并两次滤液，混匀，加热浓缩成1g/ml的还少丹水煎液，置冰箱中保存备用（冰箱中保存时间不超过四天）。

1.3动物分组与给药方法：依大鼠性别、体重分层，随机分成老年对照组和老年药物组，每组12只。药物组用还少丹水煎液灌胃2mL（含生药7g）/（kg.d），其药物剂量按人体体表面积计算，大鼠灌胃剂量相当于成人剂量的5倍，对照组用等量生理盐水灌胃，灌胃5d/周，另2d自由饮药。饲喂80d。

1.4鼠肝DNA增色效应的检测：大鼠饲喂80d后，断头处死，取鼠肝提取DNA。参照徐桂香[3-4]法，检测鼠肝DNA增色效应，以ApH12.5表示pH12.5时的A260，ApH7.0表示ApH7.0时的A260，按[ApH12.5-ApH7.0/ApH7.0]×100％计算DNA碱变性增色效应．

1.5鼠肝丙二醛和脂褐素的检测：依照试剂盒说明书操作，在532nm处测OD值，测定丙二醛含量；脂褐素的检测，用氯仿与甲醇混合液萃取，用荧光分光光度计以0.1μg/ml的奎宁液为标准，氯仿甲醇混合液为空白，狭缝4.4，灵敏度3.6，激发波长360nm、发射波长450nm测其荧光强度，计算脂褐质的含量。

1.6统计学分析：采用SPSS11.5统计学软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。

2结果

2.1还少丹对老年大鼠肝细胞染色质DNA损害的保护作用（结果见表1）

*与老年对照组比较，老年大鼠肝脂褐素平均降低率为50.7％。

注：t=3.25，p<0.01。由表3可见，老年药物组肝脂褐素含量显著低于老年对照组，其降低率为50.7％，说明还少丹能降低肝脂褐素的生成。

3讨论

众多学者认为衰老的重要机制之一是染色体DNA结构损伤，其损伤包括基因突变和DNA链断裂。DNA链断裂后，断裂的DNA链易于变性，导致DNA增色效应增高。衰老生物在长期生活过程中，因受到各种物化因素的攻击，可导致DNA链断裂[5]增加，而DNA链断裂数越多，碱变性增色效应亦越高。有报道认为[6]，老年大鼠肝DNA碱变性增色效应高于青年大鼠，说明DNA链断裂随年龄的增加而增加。DNA链断裂直接影响基因信息的正常表达，基因表达异常可产生突变的蛋白质；基因表达障碍使蛋白质表达量降低，可导致老年性记忆减退、智力障碍及肌肉萎缩等症。近年来，关于自由基和活性氧损害DNA，导致DNA断裂或突变的证据越来越多。有报道认为[7]由过氧化氢所引起的DNA的氧化损伤能大大提高重复序列的不稳定性。有报道认为[8]端粒长度随着细胞逐代相传而缩短，说明DNA单链断裂发生于染色体末端，导致端粒缩短加快。以上证实了DNA断裂与衰老的关系，本实验老年药物组大鼠肝DNA碱变性增色效应低于老年对照组大鼠，说明还少丹具有拮抗DNA链断裂、保护DNA结构免受损害的作用。同时，我们从实验中发现还少丹具有抗自由基和活性氧[9-11]的作用，该方可能是通过抗自由基和活性氧的机制控制了DNA的断裂损伤，这一观点亦支持了殷铭俊[7]等报道的抑制脂质过氧化作用，可防止DNA链断裂的观点。

肝脏是物质代谢中心，被誉为“最大的化工厂”。肝细胞每时每刻都在进行各种代谢变化，而物质代谢过程中不断产生自由基，机体能有效地清除自由基，从而防止了自由基对机体产生毒害作用。但是，人随着年龄的增长，清除自由基的能力下降，导致自由基积聚，如过氧化脂质的代谢产物丙二醛能与蛋白质发生交联，生成脂褐素。脂褐素是一种不溶性颗粒，沉积在肝脏，可影响肝细胞的代谢与功能，因它无法被降解，可能与肝纤维化相关。在延缓衰老的研究中，有报道[12]论述了脂褐素与衰老的相关性；有报道认为[12]氧化应激与肝纤维化密切相关，天然中药抗氧化成分能抑制肝纤维化的作用；有报道认为[13]中药黄芪的提取物沙苑子黄嗣具有抗肝纤维化的作用；中药天年饮可提高衰老机体的抗氧化能力，改善肝细胞脂质代谢、保护肝细胞的功能；补肾抗衰老复方中药时明显抑制MDA水平；有报道[14]用实验证明了抗衰中药能降低老龄小鼠肝脂褐素的含量；首乌能抑制脂褐素在人体器官内的沉积，本实验还少丹能降低老年大鼠肝丙二醛和脂褐素的含量。

综上所述，自由基和活性氧损害DNA，导致肝DNA断裂增加；肝脂质过氧化产物MDA和脂褐素的含量随氧化作用的增强而增多，造成对肝脏的损害，也是肝衰老的主要原因。现代研究证实，抗衰老中药能有效改善衰老大鼠的肝脏功能，提高肝脏组织的抗脂质过氧化的能力[15]。本研究的中医古方还少丹具有补肾益精，使人延年不老的作用。本研究的结果分析提示：还少丹通过提高老年大鼠清除自由基和活性氧的能力，达到了延缓肝衰老的目的。

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