左旋精氨酸对脑缺血再灌注大鼠脑梗塞范围的影响

左旋精氨酸对脑缺血再灌注大鼠脑梗塞范围的影响

张晶晶1董化江1罗悦晨2

张晶晶1董化江1罗悦晨2

（1.天津武警医学院附属医院300162;2.天津医科大学研究生院300162）

作者简介：张晶晶（1980-)，女，医师，住院医师，本科，研究方向：致力于呼吸系统疾病尤其是间质性肺疾病的诊断及治疗及各科危重症疾病的救治。通讯作者：董化江。

【摘要】目的：观察左旋精氨酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后ET-1的影响。方法：60只Wistar大鼠成功建立脑缺血再灌注模型并随机分为对照组、缺血30min组、缺血30min+再灌注0.5h组、缺血30min+再灌注1h组、缺血30min+再灌注2h组及L-arg+缺血30min+再灌注1h组；酶动力法测定CK、LDH活性；ELISA试剂盒测定血清、脑组织中ET-1的活性，Westernblot检测ET-1在脑组织中的变化。结果：脑缺血再灌注各组损伤导致血管内皮细胞损伤ET-1大量释放，且再灌注组高于缺血组，缺血组高于对照组，Westernblot趋势同上。结论：在脑缺血再灌注某些阶段可使用L-arg逆转ET-1的异常变化减轻缺血再灌注损伤。

【关键词】左旋精氨酸；脑缺血再灌注损伤；内皮素-1

【中图分类号】R743【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）02-0020-02

缺血性脑血管病已成为威胁人类健康的主要疾病之一。脑缺血再灌注损伤是一种以氧化应激反应亢进、造成缺血的组织器官可逆性缺血损伤加重，或促进可逆性损伤转化为不可逆行损伤的病理过程，在临床上对发生脑缺血性疾病的患者生命威胁很大，因此研究脑组织缺血再灌注损伤机制寻找新的治疗靶点尤为迫切。内皮素-1强大的缩血管效应所致的无复流现象为I/R损伤的重要机制之一[1]，而左旋精氨酸（L-arginine，L-Arg）可通过影响ET-1有效地防治脑I/R损伤[2]。

1材料与方法

1.1采用可逆性大脑中动脉线栓塞法制成局灶性脑缺血再灌注模型[1]。以10％水合氯醛(350mg／kg)给大鼠腹腔注射麻醉，仰卧位，于颈部皮肤行正中纵行切开，正中切开颈部皮肤，分离一侧颈外动脉和颈内动脉主干及分叉处结扎颈外动脉，用动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉的分叉处，然后在颈外动脉远端结扎处附近剪一小口，取头端呈鼓锤状的单丝尼龙线，由颈外动脉经颈内动脉插入深度约18-20mm微遇阻力时停止，此时尼龙线头端已到达颈内动脉分叉为大脑中动脉和大脑前动脉处。用缝合线系住栓塞线，确认无出血后缝合皮肤。缺血30min时将单丝尼龙线拔出形成再灌注，再灌注0.5h、1h、2h。再灌注同时各给药组分别由腹腔注射相应剂量的药物。假手术组不插入单丝尼龙线，其他步骤同手术组。在舌动脉和颌动脉缺血30min(I-30min)、再灌注30min(R-30min)、再灌注60min(R-60min)、再灌注120min(R-120min)分别采集股动脉血1.8ml,注入盛有0.13mol/L枸橼酸钠0.2ml的塑料试管中,即刻混匀,3000r/min离心10min,取血浆于-40℃保存待检。

1.2各组CK、LDH、ET-1活性的检测：各组大鼠达预计时间点后即刻开胸右心房取血，并立即低温(4℃,3000rmin-1离心10min)分离血清，按照试剂盒说明书用紫外分光度法检测LDH、CK活性；ET-1的测定按照大鼠ET-1ELISA试剂盒（上海西唐生物科技公司）操作。

1.3心肌组织蛋白的提取及Westernblot：取各组大鼠结扎线下左室游离壁、前下壁心肌组织，剪碎加入200μl裂解液，研磨至组织无肉眼可见碎片，用200μl裂解液冲洗研磨器，4℃，3000rmin-115min，取上清即为总蛋白；10%SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，经4℃，320mA，2h恒流电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭1.5h，按1：100的稀释比加入兔抗人的AFP抗体和按1：1000的稀释比加入内参GAPDH抗体，4℃孵育过夜，次日1×TBST洗膜20min后，按1：1000的稀释比加用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1.5h，1×TBST洗膜20min后，X光片于暗室曝光。显色条带用LabWorksTM凝胶成像系统进行密度扫描。

1.4统计学处理应用SPSSI3．0统计软件，数据以均数标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1脑缺血再灌注不同阶段血浆中ET-1水平的变化，见表1。

2.2脑缺血再灌注不同阶段脑组织PCR,WesternblotET-1水平的变化，见图1，2,3。

3讨论

脑血管疾病目前已成为严重危害人类健康的主要疾病之一，研究抗缺血性脑血管疾病的药物是药理学的重要任务。现已明确，脑缺血后相当部分的血管能自然再通或溶栓治疗后血流恢复再通，当供血恢复后，恢复的灌流终止了缺血损伤的过程，并至少使部分可逆的损伤组织的功能得到恢复。但血流恢复后导致部分受损的脑细胞继续死亡，这种有害作用称作“再灌注损伤”，由于此类疾病发病率高，对人类健康危害极大，因此局灶性脑缺血再灌注损伤发病机制及治疗药物的研究为大家所关注。在缺血性脑损伤中，经常采用的动物模型有全脑和局灶性脑缺血模型[3,4]。临床上常见的是局部或区域性脑缺血，大脑中脑动脉闭塞(MCAO)造成的动物模型类似临床脑卒中情况。研究已表明，大鼠大脑中动脉闭塞后在急性期脑梗塞范围最大，同时，大鼠神经行为缺失症状严重，尚伴有较为严重的脑水肿。本实验结果与之相符。红景天是青藏高原特有的药用植物，近年来研究发现对离体的缺氧／缺糖损伤神经细胞有很好的保护作用，但尚无其对整体脑缺血再灌注损伤动物作用的研究报道。

研究表明在脑缺血再灌注损伤各阶段ET-1在血清及蛋白水平均升高且存在一定的规律性，即再灌注组高于缺血组，缺血组高于对照组；在该模型上L-Arg可降低血清及脑组织中的ET-1对脑起到保护作用，因此可以尝试通过L-arg对ET-1进行干预减轻MI/R损伤。

参考文献

[1]董化江，徐鹏霄.内皮素的研究进展[J].武警医学院学报，2009，18(6):557-560

[2]LongaEZ，WeinsteinPR，Carlsons，etal．Reversiblemiddlecerebralatteryocclusionwithouteraniectomyinrats[J].Stroke，1989，20(1):84-91

[3]ZausingerS，HungerhuberE，BaethmannA，etal．Neurologicalimpairmentinratsaftertransientmiddlecerebralarteryocclusion：acomparafivestudyundervarioustreatmentparadigms[J]．BrainRes，2000，863(1-2):94-105.

[4]董化江，罗悦晨，夏丽，等.L-arg对急性心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮素-1的影响[J].天津医科大学学报，2010，18(3):441-444