孕酮对缺血再灌注沙土鼠海马CB神经元的保护作用

孕酮对缺血再灌注沙土鼠海马CB神经元的保护作用

褚丽芳1张震2李双成3*王建华1

褚丽芳1张震2李双成3*王建华1

（1河北省人民医院神经内科050051）

（2河北省廊坊卫生职业学院065000；3河北医科大学神经生物研究室050017）

【中图分类号】R741【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）19-0047-03

【摘要】目的观察孕酮对脑缺血沙土鼠海马钙结合蛋白CalbindinD-28k，即CB免疫反应的影响。方法以颈总动脉夹闭法制作脑缺血再灌注模型、免疫细胞化学方法显示海马CB免疫反应的变化。结果脑缺血再灌注后1～7天，背侧海马CA1区CB阳性神经元开始出现并且数量增多；第7天背侧海马CA1区锥体细胞层呈现CB阳性死亡着色致密条带。孕酮处理后背侧海马CA1区CB阳性神经元进一步增加，且有较长的突起伸至腔隙分子层，未见海马CA1区锥体细胞层CB阳性死亡着色致密条带结构。结论孕酮具有一定的神经保护作用，调控CB的表达可能为孕酮的作用机制之一。

【关键词】孕酮脑缺血钙结合蛋白沙土亚科

孕酮（progesterone）作为一种能在神经系统合成的神经活性甾体，通过对神经系统结构和功能的影响，发挥其神经营养和保护作用。研究表明，在各类动物模型中孕酮替代治疗可延缓神经细胞凋亡、减小脑梗死体积、减轻实验性脑缺血损伤、促进神经髓鞘的合成，并且能改善实验动物空间辨别和学习记忆等神经认知功能[1,2]。研究发现，孕酮对脑缺血再灌注后海马CA1区锥体细胞具有明显的神经保护作用。钙结合蛋白CalbindinD-28k，即CB可通过结合胞内钙离子、对抗脑缺血引起的钙超载[3]，孕酮处理后海马CB免疫反应变化如何目前知之甚少。本研究以颈动脉夹闭法制作沙土鼠脑缺血模型，观察孕酮对脑缺血沙土鼠海马CB免疫反应的影响，探讨孕酮对脑缺血神经保护作用的可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组健康雄性沙土鼠75只（首都医科大学实验动物中心选购），鼠龄4-5个月，体质量50-70g。随机分为假手术组、脑缺血再灌组和孕酮处理组3组，每组25只。孕酮处理组参照Jiang等[4]的给药剂量，分别在血流恢复后即刻、6h、12h、24h及48h给予腹腔注射孕酮(4.0mg/kg)。

1.2动物模型的制备脑缺血再灌组和孕酮处理组经乙醚麻醉后，按Zealonga等[5]的方法，行颈正中切口，游离夹闭双侧颈总动脉、阻断血流20min后，去除动脉夹，缝合切口，制成沙土鼠脑缺血再灌注模型。假手术组除不夹闭颈总动脉外，其余同上。

1.3标本制备各组动物在预定存活时间2d或7d，经心灌注生理盐水50ml和4℃4%多聚甲醛固定液（pH7.6）400ml后，开颅取脑，于4%多聚甲醛中后固定4h，30%蔗糖过夜，冠状位冰冻切片厚40μm，间断集片于0.01mol/L，pH7.6PBS中，行免疫细胞化学反应。用1:2000小鼠抗CB抗体(sigma)于4℃孵育切片48h；1:400生物素化第二抗体室温2h；1:400HRP结合链霉亲合素室温1h；行DAB呈色。免疫细胞化学对照实验以PBS代替CB抗体进行反应，其结果为阴性。切片脱水、树脂封片。

1.4细胞计数及免疫细胞化学染色每只动物随机选择3张切片的背侧海马CA1区、CA3区锥体细胞层及齿状回颗粒细胞层，观察并计数神经元，因数量较少数据并未列出。依据免疫反应强度分为五级，-，未检测出；±，偶见表达；+，表达较弱；++，中等强度表达；+++，强阳性表达。

2结果

免疫细胞化学染色发现，假手术组沙土鼠齿状回颗粒细胞及突起CB免疫反应呈强阳性，强阳性的CB免疫反应颗粒细胞及突起之间彼此界限不清表现为一致密带，同时可见自海马齿状回至海马CA3区汇集的CB阳性苔藓纤维。背侧海马CA1区、CA3区锥体细胞层为CB阴性，在CA1区起层、放射层及腔隙分子层可见散在的CB阳性神经元，在齿状回门区偶见散在的阳性锥体细胞（图1,表1）。腹侧海马CA1区锥体细胞层浅层可见大量CB阳性锥体细胞，其较长的顶树突经放射层伸向腔隙分子层并与该层的CB阳性中间神经元及树突交织成网状。

脑缺血各时程组背侧海马CA1区、CA3区起层、放射层的CB阳性非锥体神经元未见改变。脑缺血第2d，背侧海马CA1区锥体细胞层隐约可见CB阳性细胞、并较具细胞形态（图2）；第7d，该区锥体细胞层细胞明显固缩、表现为深染致密的棕黄色条带-点状影像、无细胞轮廓-死亡着色（图3,表1）。但脑缺血第7d，腹侧海马CA1区没有死亡着色现象，仍可见大量的CB阳性锥体细胞及其突起。

孕酮实验组与假手术组及脑缺血组相比，最大不同之处即表现在背侧海马CA1区上，其他部位未见明显区别。本组第2d，可见背侧海马CA1区锥体细胞层的锥体细胞表达CB，其阳性细胞呈弱至中等反应强度、具有较长的突起伸至腔隙分子层，细胞形态清楚（图4，表1）。第7d，背侧海马CA1区锥体细胞层未见脑缺血组细胞固缩的棕黄色点状颗粒影像，背侧海马CA1区锥体细胞层可见大量的CB弱阳性的细胞，具有较明显的细胞形态，较长的阳性顶树突像第2d样伸至腔隙分子层（图5，表1）。

3讨论

本研究发现沙土鼠脑缺血再灌注后，背侧海马CA1区CB阳性神经元出现并且数量增多，与Yenari等[6]研究结果相符。海马CB阳性神经元数量增加可能与脑缺血后钙离子内流、CB与之结合提高检出率有关[7]；也可能与脑缺血后兴奋性氨基酸大量释放，引起胞外钙离子内流[8]、诱发神经元合成更多的CB以增强缓冲胞内钙离子的能力有关。脑缺血再灌海马CA1区出现迟发性细胞死亡后，仍可见许多CB阳性神经元，我们在脑缺血再灌7d所观察到的海马CA1区CB阳性致密条带（密集点状死亡着色）可能是锥体细胞迟发性死亡后、分布于锥体细胞层的CB阳性纤维末梢固缩浓聚而致[9]。本研究发现，孕酮可提高脑缺血再灌后海马CB阳性神经元数量、增加CB阳性纤维突起(特别是第7d)，这可能与孕酮的神经保护作用有关。

沙土鼠脑缺血再灌后,孕酮对海马CA1区锥体细胞具有明显的神经保护作用[9-11]。在Cervantes等[12]的实验中，发现孕酮不仅可以减少尾状核神经元的丢失，而且可增强黑质GABA能神经元的兴奋性抑制作用。孕酮对脑缺血的神经保护作用除可能通过清除自由基、加强GABA和(或)抑制兴奋性氨基酸及其受体的活性[10,12]、减少诱生型一氧化氮合酶的表达，从而对非CB神经元发挥保护作用外[13]，还可能通过孕酮受体调控CB神经元蛋白的表达、发挥神经保护作用。我们观察到的CB在脑缺血孕酮组的免疫反应变化很可能是神经元CB表达增加的结果。已知分布于脑内的孕酮受体有雌激素诱导型和非雌激素诱导型，孕酮可能通过非雌激素诱导型孕酮受体，促进了脑缺血再灌后CB的表达，从而增强对胞内钙离子的缓冲能力、对脑缺血受损神经元起到保护作用，对此尚待进一步的研究证实。

尽管孕酮作用机制尚不很清楚，但对这一传统类固醇激素毕竟有了新的认识，而最近不断的一些新发现也逐渐引起人们对其在临床应用上的一些新思索。

参考文献

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图版说明

图1假手术组海马CB免疫细胞化学染色，A×40;B×200.

图2缺血再灌后2d海马CB免疫细胞化学染色，A×40;B×200.

图3缺血再灌后7d海马CB免疫细胞化学染色，A×40;B×200.

图4缺血再灌孕酮处理2d后海马CB免疫细胞化学染色，A×40;B×200.

图5缺血再灌孕酮处理7d后海马CB免疫细胞化学染色，A×40;B×200.

Fig1CBimmunoreactivityinhippocampusofsham-operated,A×40;B×200.

Fig2CBimmunoreactivityinhippocampusaftercerebralischemicreperfusion2d,A×40;B×200.

Fig3CBimmunoreactivityinhippocampusaftercerebralischemicreperfusion7d,A×40;B×200.

Fig4CBimmunoreactivityinhippocampusafterprogesteronetreatmentfollowingcerebralischemicreperfusion2d,A×40;B×200.

Fig5CBimmunoreactivityinhippocampusafterprogesteronetreatmentfollowingcerebralischemicreperfusion7d,A×40;B×200.

-，未检测出；+，表达较弱；++，中等强度表达；Deathstain，死亡着色