生物发光法在微生物检验中的应用及研究进展

生物发光法在微生物检验中的应用及研究进展

谢汉瑛

兴业县人民医院广西兴业537800

摘要：生物发光是由于生命活体、生物体本身所产生的一类特殊的化学发光现象，促进生物体本身发光需要利用激发能，这种激发能来自于生物体内酶的催化反应。生物发光法是一种快速的微生物检验法，由于生物发光法具有操作简便、灵敏度高、能够随时进行检测等一系列优点，所以其在微生物的检验中应用的非常广泛，本文首先就生物发光法在微生物检验中的应用原理及在微生物检验中的应用步骤进行详细阐述，然后就影响生物发光法在检验过程中的主要影响因素进行了分析；最后，对生物发光法在微生物的检验中的具体应用以及研究进展进行了剖析，本研究对于促进生物发光法在微生物检验中的良好应用有非常重要的意义。

关键词：生物发光法；微生物检验；研究进展；快速检测；生物酶

1.前言

微生物的检验涉及到的方面非常广泛，特别是在食品加工的过程中对食品的质量进行严格的监控[1]。如果对食品中的细菌检验采用常规的方法检验，就必须采用琼脂平板菌数计数法，但是这种检验方法需要2-3天的时间才能出结果，所以这种检验结果对食品检验有很大的滞后性，由于很多食品必须在生产的当天进行出售，所以采用常规的琼脂平板菌计数法显然不能满足实际的检验需要，因此对于生物菌的快速测定需要有即时性的微生物检测方法进行快速、准确的检测[2]。所以有需求就有市场，生物发光法以其快速、准确的测定优势得到了国内外的广泛关注，目前在微生物检验中得到了广泛的应用。

2.关于生物发光法的阐述

2.1生物发光法在微生物检验中的应用原理

生物发光法是属于化学发光范畴的，是由于生命活性生物体产生的发光现象[3]，发光需要生物体内的激发能，激发能来自于生物体内的荧光素酶的催化作用，生物发光主要有两种类型：萤火虫生物发光和细菌生物发光等，萤火虫生物体发光又需要有ATP参与，所以萤火虫生物发光又被称为ATP依赖性生物发光[4]。下面对萤火虫生物发光和细菌生物发光的应用原理进行分别阐述。

首先，萤火虫生物体发光，这种ATP依赖性的生物发光反应，主要是依靠萤火虫的荧光素和荧光素酶在ATP、镁离子和氧气等条件的存在下进行发光的反应，由于在萤火虫生物体发光需要ATP的全程参与，所以发出的光亮和最大的光强度与ATP的含量呈正比例关系[5]。由于在微生物的体内大量存在ATP，所以检测ATP是否存在就能检测出标本中是否有微生物存在，这种检测方试简单、精确。第二种生物发光法是细菌生物发光，在发光的细菌体内含有两种酶，分别是细菌荧光素酶和NAD：FMM氧化还原酶，细菌荧光素酶存在的条件需要在有氧气存在的情况下，然后使得FMNH2氧化，生成物为FMN和长链脂肪酸，然后发出光亮[6]。

3.生物发光法的影响因素

生物体在发光过程中，发光强度受到很多因素的影响，这里重点对ATP生物发光法中影响生物发光的主要因素进行分析[7]。首先，pH对生物发光的发光强度有影响，根据一系列的调查研究发现，ATP生物发光反应最适宜的pH范围为7.4-7.8；温度对ATP生物发光反应也有影响，最佳的反应温度为24-26℃，当温度大于25℃的时候荧光酶素开始变得不稳定，所以当使用ATP生物发光法测定微生物时应该将室内的温度控制在合理的范围内；其次，酸、碱、盐及表面活性剂对ATP生物发光也有一定的影响[8]；其次，在待测微生物样品中由于含有一些离子，这些离子也可能对测定造成影响；另外，待测样品提取液的颜色对发光强度也有一定的影响，根据研究发现细菌ATP提取液的颜色越深，对于ATP发光强度的影响越大，所以在采用ATP生物发光法进行测定时，需要将提取液的颜色考虑在内，最大限度的保障测定结果的准确性[9]。

4.生物发光法在微生物检验中的具体应用及研究进展

生物发光法在微生物的检验中有着非常广泛的应用，主要应用于微生物的快速检测和对抗生素的敏感性的快速测定方面，下面对这两种主要应用进行详细的阐述。

4.1应用于微生物的快速检测

生物发光法中的ATP生物发光法应用的尤为广泛[10]。例如生物发光法在菌尿的快速筛选中有广泛的应用，根据相关研究发现在尿液标本中含有的细菌物质能够产生大量的非细菌类的ATP，所以对实验结果产生极大的干扰，为了消除非细菌类的ATP的干扰，在测定之前首先需要将非细菌类的ATP分离到细菌的细胞之外，然后再使用焦磷酸酶将非细菌类的ATP破坏[11]。在上个世纪80年代就有研究者将ATP生物发光法应用于宇航系统水中的微生物的快速测定中，伴随着社会的不断发展，人口数量的急剧增多，食品加工行业发展的特别迅速，所以生物发光法在食品加工行业中广泛的应用于微生物的检测[12]，例如在酸奶的制作过程中如果采用传统的平板菌数计数法来测定在酸奶发酵过程中的乳酸杆菌的数量，由于传统方法测定的时间漫长，所以测定的细菌含量的结果往往非常滞后，根据可靠的研究表明，酸奶中乳酸菌的数量和ATP浓度随着发酵时间的增加而增加[13]，所以采用ATP生物发光法测定酸奶中乳酸杆菌的数量是一种快速可行的方式[14]。

另外，生物发光法还广泛的应用有食品的生产环境清洁程度的检测中，传统的食品生产环境的清洁度管理往往是采用棉拭取检测微生物的方法进行[15]，然后依据表面附着的微生物的含量为指标，对微生物的含量进行检测，但是主要检测方法还是利用平板培养法，这种测定方法在测定当天根本无法检测出结果[16]，所以对食品生产环境的要求是不能满足的，由于食品中都含有ATP，并且ATP有耐高温的特性，所以即使食品经过了加工和烹饪过程中的加热环节，食品中仍然存有ATP，所以利用这种优势，采用ATP生物发光法检测食品生产环境的清洁度是非常可行的[17]，此外还可以利用ATP生物发光法检测生产线、食品操作台等处的清洁程度，这种方法在国外已经得到了广泛的应用。但是在国内的发展还是不是特别成熟，仍有待进一步的研究[18]。

4.2应用于抗生素的敏感性快速测定

生物发光法除了应用于微生物含量的检测中，还广泛应用与抗生素敏感性的快速测定中[19]。在上个世纪，就有国外的科学家将生物发光法应用到人体血清中庆大霉素浓度的快速测定中，测定原理是细菌培养物中含有的ATP，然后利用含有ATP的总浓度为基准进行庆大霉素浓度的测定[20]。生物发光法应用于抗生素敏感性的测定在国内也有很多研究，例如使用ATP生物发光法检测金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素、卡那霉素及庆大霉素等抗生素的敏感程度的测定[21]。采用生物发光法对抗生物敏感程度的测定有很大的实用意义，例如用生物发光法测定分歧杆菌对抗结核药物敏感度的测定，有相关研究将临床分离的结核杆菌的培养物暴露在稀释后的链霉素溶液中好，然后对结核杆菌培养了一周[22]。如果这些菌株对抗结核药比较敏感，就会出现ATP被抑制的情况，然后使用参考法得出结果，得出敏感和耐药之间的分界点[23]。有研究者利用基因转化的方法将抗分歧杆菌的药物的敏感性进行测定，重组的分歧杆菌能够真实的将培养物中的细菌的活力反应出来，由于根据分歧杆菌的种类不同对刚分歧杆菌药物的敏感程度也是不同的，所以一种细菌的检测结果不能代表一系列的抗生物的敏感程度，仍有待进一步进行研究[24]。

5.结语

综上所述，生物发光法在微生物的检测中已经得到了非常广泛的应用，特别是在食品加工行业和医学界，虽然对于生物发光法在微生物的检验中的研究已经取得了很大的进步，但是在具体的使用过程中仍然有很多问题，需要进一步的进行研究，完善生物发光法的使用。以上是本人的粗浅之见，由于本人的知识水平及文字组织能力有限，文中有不到之处，还望相关的专业人士批评指正。

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