姜黄素调控SESN2蛋白含量在其缓解胰岛素抵抗中的信号机理研究

姜黄素调控SESN2蛋白含量在其缓解胰岛素抵抗中的信号机理研究

周子瑜杨含艳柴单单任丽伟于志文(通讯作者)

周子瑜杨含艳柴单单任丽伟于志文(通讯作者)

（福建中医药大学药学院生物医药研发中心350122）

【摘要】目的探讨姜黄素对SESN2蛋白含量的调控与其缓解胰岛素抵抗的信号机理。方法Westernblot检测高脂诱导的胰岛素抵抗小鼠模型、KK小鼠及db/db小鼠等糖尿病模型中SESN2蛋白表达，炎症信号抑制蛋白IκB和内质网应激蛋白eIF2α磷酸化水平；培养肝癌细胞HepG2进行Sesn2siRNA转染，探讨SESN2对炎症和内质网应激信号作用；对HepG2细胞、胰岛素抵抗小鼠模型及糖尿病病人进行姜黄素干预，观察其对SESN2蛋白表达作用。结果胰岛素抵抗及糖尿病小鼠SESN2蛋白表达增加，并有炎症激活及内质网应激变化；SESN2基因沉默导致炎症信号激活及内质网应激；姜黄素干预上调SESN2蛋白表达。结论姜黄素明显上调SESN2蛋白水平，进而调控炎症及内质网应激，缓解胰岛素抵抗。

【关键词】姜黄素SESN2胰岛素抵抗炎症内质网应激

【中图分类号】R31【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）31-0082-03

前言

天然植物化学物姜黄素（curcumin，Cur）为传统中药姜黄的主要活性成分[1]。近年来已在多种动物实验中报告其改善糖耐量及对抗炎症、内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）等胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）发病病理机制作用[1-3]。但姜黄素对炎症、内质网应激调控作用的分子机理并不清楚。Sestrins(SESNs)蛋白家族是高保守的应激反应性蛋白，在哺乳动物中共有三种形式存在，即SESN1，SESN2和SESN3，其主要作用有抗氧化、调节老化过程和抑制肿瘤生长[4，5]。细胞代谢产生活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)，当ROS产生过量则会引起氧化应激，而SESN家族可以清除ROS[6]。另一方面SESN则通过调节AMPK(AMP-活化蛋白激酶)-mTOR通路，起到对胰岛素敏感性的调控作用[7，8]。目前已有研究报告长期过氧化处理HepG2细胞可以激活SESN2功能，实现对胰岛素信号及PKB活性的调控作用[9]。

材料与方法

材料与试剂：8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠、普通饲料（4.5％脂肪）、高脂饲料（45％脂肪）购自广东省医学实验动物中心；KK小鼠购自北京华阜康公司、db/db小鼠购自南京实验动物研究中心；HepG2细胞购自中科院上海细胞库；高糖DMEM培养基、青链霉素、胎牛血清、EDTA-胰酶、opti-MEM培养基、Lipofectamine2000TM均购自Invitrogen公司；外周血淋巴细胞提取试剂盒购自上海科华生物公司；血糖测定采用鱼跃血糖仪及试纸；IκB、p-eIF2α抗体均购自CellSignalingTechnology公司；Sesn2和β-actin抗体购自ProteintechGroup公司；羊抗兔-HRP二抗、羊抗鼠-HRP二抗、Sesn2siRNA及controlsiRNA均购自SantaCruz公司；BCA蛋白浓度测定盒购自上海碧云天公司；ECL发光液购自北京康为世纪生物科技公司；姜黄素购自加拿大ORGANIKAHealthProducts公司。

动物实验模型：8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠分别给予低脂饲料（低脂组，LF）和高脂饲料（高脂组，HF)诱导IR模型。喂养3个月后根据报告方法进行糖耐量实验[10]。造模成功后，一部分高脂组小鼠用溶于1%羧甲基纤维素钠的姜黄素（50mg/Kg）灌胃1周；KK及db/db糖尿病小鼠模型：测空腹血糖，以血糖浓度>11mM为糖尿病模型成功。在空腹过夜后取小鼠胰岛素敏感组织肌肉、肝脏、脂肪迅速置于于液氮中速冻，然后转至﹣80℃冰箱冻存。

细胞培养及细胞转染：人肝癌HepG2细胞以含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37℃及5%CO2的培养箱内进行培养，并每2-3天更换培养基。细胞传代时，用EDTA-胰酶消化并按照1:4比例进行传代。细胞转染按照Lipofectamine2000TM试剂说明书操作。

细胞及组织蛋白样品制备：HepG2细胞经实验处理后，用冰PBS洗涤3次，然后加入预冷细胞蛋白裂解液。冰上裂解30分钟后以12000r/min转速离心5分钟并收集上清液；病人淋巴细胞提取后，直接加入预冷细胞蛋白裂解液，其余操作同上；动物组织，加入预冷细胞蛋白裂解液，使用组织匀浆器研磨30-50次，并按上述方法离心；使用BCA蛋白浓度测定盒测定蛋白浓度。蛋白加入样品上样缓冲液后于95℃，变性5min。

蛋白印迹实验(Westernblot)：取等量蛋白样品于聚丙烯酞胺凝胶中，以100V电泳150min，100V转膜75min至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，然后分别用相应一抗((1:1000稀释)在4℃下孵育过夜。后将膜与HRP标记的二抗((1:2000稀释)室温孵育2h，用ECL化学发光底物与膜孵育5min后，曝光显影。

结果

1胰岛素抵抗及糖尿病小鼠SESN2蛋白表达增加

HF组小鼠糖耐量结果显示血糖较之于LF组明显升高（*，p<0.05，**，p<0.001）；HF组小鼠的胰岛素敏感组织肌肉、肝脏、脂肪SESN2蛋白表达增加（图1A）；2型糖尿病模型KK小鼠和db/db小鼠肝脏组织SESN2相对于对照组蛋白表达明显增加（图1B、C）。

图四、姜黄素上调SESN2作用

讨论

氧化应激是胰岛素抵抗的重要发病因素。目前有观点认为胰岛素抵抗和糖尿病情况下，细胞内ROS积蓄造成的氧化应激可以诱导炎症激活和内质网应激（ERS），后两者均可抑制胰岛素受体底物1（IRS1）磷酸化，从而损害胰岛素信号传导，产生胰岛素抵抗[11]。

SESN2受氧化应激刺激而升高。另外据报告，SESN2参与胰岛素信号传导的调控并起到增强胰岛素敏感性作用[5，12]。因此本实验发现的在IR及糖尿病小鼠的脂肪和肝脏中，SESN2蛋白表达水平升高，可能是机体对氧化应激的一种代偿性和保护性的升高，以对抗氧化应激对胰岛素信号的阻碍作用。由于我们在细胞实验中发现，SESN2基因沉默对NF-ΚB抑制性蛋白IΚB及内质网应激信号eIF2α具有明确的调控作用，揭示SESN2可以通过抑制炎症及内质网应激信号，进而解除二者对胰岛素信号的传导抑制性影响，起到增敏胰岛素作用。研究表明，氧化还原状态与炎性信号及内质网内环境稳态关系密切。另有研究证实，通过SESN2基因沉默技术可以导致ROS的细胞蓄积，反之SESN1或SESN2基因的过度表达可减少细胞ROS水平[5，6]。因此我们的结果进一步提示SESN2可能通过调节细胞氧化还原状态从而影响炎症和内质网应激信号。

姜黄素为咖喱中有效成分，由于其天然低毒及对于多种疾病的广泛治疗作用而受到关注。其药效机理已知的是其具有明显的抗氧化作用[1]。我们曾报告，整体动物研究中姜黄素可以对抗线粒体氧化应激，且对炎症相关信号和内质网应激具有抑制作用[1]。在本工作中我们发现姜黄素无论对胰岛素抵抗还是多种糖尿病均具有明显的上调SESN2蛋白水平作用。结合上述SESN2调控炎症及内质网应激的实验结果，本工作阐释了姜黄素通过SESN2蛋白抑制炎症和内质网应激信号的分子作用的相关机制。这一新的作用靶点的发现鉴定，为其防治糖尿病及其其临床应用转化提供了药理作用基础。

致谢

本课题在康复技术协同创新中心（CollaborativeInnovationCenterforRehabilitationTechnology）和国家中医药管理局中医康复研究中心（TCMRehabilitationResearchCenterofSATCM）资助下完成。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金(NO.81270886)