不同方法制备的1型肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗生化及免疫学特性比较

不同方法制备的1型肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗生化及免疫学特性比较

戴吉平

戴吉平

(湖南省怀化市辰溪县博爱医院检验科419500）

【摘要】目的比较不同方法制备的1型肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗生化及免疫学特性。方法采用胺还原法以及溴化氰活化法分别对结合物进行制备，并采取生化以及免疫学检测的方式对其进行检测。结果相对于胺还原法制造出来的结合物，利用溴化氰活化法具有较高的高分子结合物含量以及较高的结合率，与此同时，免疫小鼠产生的抗体提高的也十分明显。结论相对于胺还原法制造出来的结合物，利用溴化氰活化法对1型肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗进行制备要优。

【关键词】溴化氰活化法胺还原法结合疫苗

【中图分类号】R186【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）13-0027-03

Thepreparationmethodofthetype1pneumococcalpolysaccharide-proteinbindingbiochemicalandimmunologicalcharacteristicsofvaccine

DAIJi-ping

(DepartmentofHunanprovinceHuaihuacityChenxicountyhospital419500)

【Abstract】ObjectiveTocomparethedifferentmethodsofpreparationoftype1pneumococcalpolysaccharide-proteinconjugatevaccinebiochemicalandimmunologicalproperties.Methodsaminereductionandcyanogenbromideactivationmethodwasusedtoconjugatepreparedandtakebiochemicalandimmunologicaldetectionmethodsforitsdetection.Theresultsrelativetotheaminereductionconjugatesproducedusingcyanogenbromideactivationmethodcombinedwithhighpolymercontentandhigherbindingrate,whiletheimmunizedmiceproducedantibodiesincreasedverysignificantly.Conclusionreductionrelativetotheamineconjugatesproducedusingcyanogenbromideactivationmethodfortype1pneumococcalpolysaccharide-proteinconjugatevaccinepreparedtoexcellent.

【Keywords】cyanogenbromideactivationmethodaminereductionconjugatevaccine

肺炎链球菌存在着荚膜，属于革兰阳性菌的一种。以其荚膜多糖的抗原性为根据，可以对其进行不同血清型的划分。而且在性质、组成以及分子结构等各方面各血清型加膜多糖具有不同的地方，所以在对多糖-蛋白结合疫苗进行制备的时候，需要采用不同的偶联方法，要以结合疫苗的免疫效果以及多糖的结构进行最终决定。一些需要对多糖进行修饰，而另一些则需要对载体蛋白进行修饰，最终的目的就是促进结合疫苗的免疫原性及抗原性的最大限度的提升。现在一般都是采用溴化氰活化法及胺还原法来进行载体蛋白以及多糖的偶联。采用对溴化氰对糖分子主链进行随机活化，从而使其将多个连接位点形成，对上间隔剂己二酸二肼进行连接，在多位点结合载体蛋白，这种方法就是所谓的溴化氰活化法；通过碘酸钠将多糖分子上的邻位羟基在氧化作用下转化为醛基，然后在载体蛋白上的氨基的作用下将Schiff碱形成，最终经过硼氢化钠的作用被还原成具有稳定结构的结合物，这种方法就是所谓的胺还原法。在本次试验当中，利用胺还原法以及溴化氰活化法进行1型肺炎球菌荚膜多糖(PS1)-破伤风类毒素(TT)结合疫苗的制备，同时还比较了其动物免疫效果、高分子产量、产率以及制备的过程，从而希望能够将合适的连接方式找出来。

1.资料与方法

1.1菌种

由相关检定所提供的62002株1型肺炎球菌，再加上本所制备的1型肺炎球菌多糖。

1.2精制破伤风类毒素（TT）

经过相关的设备对精制破伤风类毒素进行纯化，对之进行超滤浓缩以及杀菌过滤，最终对蛋白含量进行准确的测定，在四摄氏度的环境中予以保存。

1.3抗血清

采用体重达二公斤到二点五公斤的家兔作为对象，经耳缘静脉分别在第七天、第十四天以及第二十一天进行免疫，分别采用1型肺炎球菌十亿、二十亿以及四十亿每只的剂量。在第二十八天进行动脉采血，对其血清进行分离，在零下七十度的环境当中予以保存；抗TT马血清作为抗TT血清[1]。

1.4实验小鼠

采用NH雌性小鼠作为试验小鼠，实验小鼠的体重为十二克到十四克。

1.5化学试剂

采用和硼氢化钠(NaBH4)、过碘酸钠(NaD4)、碳二亚胺(EDAC)、己二酸二肼(ADH)以及溴化氰(CNBr)作为本次试验当中的化学试剂。

1.6结合物制备

1.6.1胺还原法

采用NaD4对多糖抗原进行为期一个小时的氧化，用乙二醇将过量的NaD4除去，将TT加入到其中，放在三十七摄氏度的环境当中进行为期十天的反应，然后再在NaBH4的作用下向稳定的结合物结构进行还原，再利用SepharoseCL-4B对之进行纯化[2]。

1.6.2溴化氰活化法

在EDAC作用下将载体蛋白与ADH进行连接，然后进行透析从而将剩下的ADH除去，对其进行一定体积的浓缩，对其蛋白含量进行准确的测定，再利用CNBr对多糖抗原进行火化，结合衍生蛋白，最后利用SepharoseCL-4B对结合物进行纯化[3]。

1.7生化检测

采用DOC法针对高分子含量进行生化检测、采用咔唑-硫酸法针对多糖含量进行检测，采用Lowry法针对蛋白含量进行检测，采用层析法对Kd值进行测定[4]。

1.8免疫学检测

1.8.1免疫双扩散

选取胺还原法以及溴化氰活化法制备的结合物，和TT抗血清以及Pn超免血清分别进行免疫扩散试验。

1.8.2动物实验

选取体重为十二克到十四克NH雌性小鼠作为研究对象，将这些小鼠随机的分为两组，将胺还原法以及溴化氰活化法制备的结合物对两组小鼠分别进行注射。在第一天、第十四天以及第二十一天对这些小鼠进行皮下注射，在第七天、第二十一天以及第三十五天在两组实验小鼠当中随机的选取10只进行采血，然后对其中的血清进行分离，在零下七十摄氏度的环境中予以保存[5]。

1.9血清学检测

针对小鼠血清抗多糖IgG水平采用ELISA间接法进行测定，采用PS1作为包被的方式，羊抗鼠IgG在经过辣根过氧化物酶标记之后作为二抗。以正常小鼠血清的十分之一稀释度时的A值为根据，从而将标准差值求出来，并对血清抗体的滴度进行计算。

2.结果

2.1胺还原法以及溴化氰活化法制备的结合物的生物特性比较

1型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(PS1-TT)结合物被胺还原法以及溴化氰活化法制备出来之后，再经过层析纯化，对其第一峰进行收集并进行检测。结果显示，胺还原法制备出来的结合物具有较低的产率、较低的高分子结合物含量以及较高的多糖蛋白比率，显示其结合反应结果不是很理想。在相对分子质量反面，两种结合物差别不大，均为0.03的Kd值。

2.2胺还原法以及溴化氰活化法制备的结合物的琼脂双扩散比较

与Pn超免血清孔处的沉淀线与胺还原法制备的结合物具有分叉，这说明有较高浓度的游离多糖存在于结合物当中；而Pn超免血清孔处的沉淀线与采用溴化氰活化法制备的结合物具有无分叉以及光滑的特点，充分说明了其良好的多糖-蛋白结合。

2.3动物试验结果比较

经过动物实验显示，相对于胺还原法制备的结合物而言，溴化氰活化法制备的结合物具有明显较高的诱导的抗体效价，差异显著具有统计学意义(t=-21908，P=0.01)。

3.讨论

相对于胺还原法制备的结合物而言，溴化氰活化法制备的1型肺炎球菌多糖-蛋白结合物具有一系列的优势。首先，溴化氰活化法制备的结合物在在生化特性方面具有较高的高分子结合物含量,以及结合率。n超免血清孔处的沉淀线与采用溴化氰活化法制备的结合物具有无分叉以及光滑的特点，充分说明了其良好的多糖-蛋白结合，其具有较低的游离蛋白含量以及游离多糖含量。而与Pn超免血清孔处的沉淀线与胺还原法制备的结合物具有分叉，这说明有较高浓度的游离多糖存在于结合物当中表明其多糖-蛋白结合不是很好，而且具有较高的游离蛋白含量以及游离多糖含量。经过动物实验显示，相对于胺还原法制备的结合物而言，溴化氰活化法制备的结合物具有明显较高的诱导的抗体效价，差异显著具有统计学意义(t=-21908，P=0.01)。

1型肺炎球菌荚膜多糖作为一个直链多糖，是由三个单糖重复单位共同构成的，其结构当中的活性基团就是羧基。为了在结合反应当中不把羧基破坏掉，这次试验对衍生蛋白的方法进行了采用，先用溴化氰将多糖活化，然后再结合衍生蛋白，也就是连接-NH2与-NH2，经过实验证明，这种方法具有较强的可行性。1型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(PS1-TT)结合物被胺还原法以及溴化氰活化法制备出来之后，再经过层析纯化，对其第一峰进行收集并进行检测。结果显示，胺还原法制备出来的集合物具有较低的产率、较低的高分子结合物含量以及较高的多糖蛋白比率，显示其结合反应结果不是很理想。在相对分子质量反面，两种结合物差别不大，均为0.03的Kd值。

利用胺还原法进行型肺炎球菌荚膜多糖结合物制备的时候，其中最为关键的一步就是NaIO4氧化多糖，其步骤为采用NaD4对多糖抗原进行为期一个小时的氧化，用乙二醇将过量的NaD4除去，将TT加入到其中，放在三十七摄氏度的环境当中进行为期十天的反应，然后再在NaBH4的作用下向稳定的结合物结构进行还原，再利用SepharoseCL-4B对之进行纯化。在氧化的过程中如果没有控制好实验条件，就会发生过氧化的现象，导致羟基氧化成了羧基，随后在结合蛋白的时候就会出现下降的结合率，最终导致结合物当中出现较高的游离多糖[6-10]。

导致人类出现脑膜炎、中耳炎以及肺炎的一个非常重要的致病因素就是肺炎球菌，现在在我国国内可以对其起到预防作用的一共有23价肺炎球菌多糖疫苗。在肺炎球菌当中具有多达九十多个的血清型，在中国的流行株当中比较多见的就是1型，进行结合疫苗的注射可以有效的起到对其的预防作用。该研究显示，相对于胺还原法制造出来的结合物，利用溴化氰活化法对1型肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗进行制备要优，值得在临床上推广和应用。

参考文献

[1]RobbinsJB,SchneersonR,ShousunCZ.Perspectivehypothesis:ser-umIgGantibodyissufficientoconferprotectionagainstinfectionsiseasesbyinactivatingtheinoculum.JInfectDis,2012,171(6):1387-1398.

[2]KuoJ,DouglasM,KimreeH,etal.Characterizationofarecombinantpneumolysinanditsuseasaproteincarrierforpneumococcaltype18Cconjugatevaccines.InfectImmun,2013,63(7):2706-2713.

[3]BitterT,MuirHM.Amodifieduronicacidcarbazolereaction.AnaBiochem,2011,4(4):330-334.

[4]GuoYY,AndersonR,MclverJ,eta.lAsimpleandrapidmethodformeasuringunconjugatedcapsularpolysaccaride(PRP)ofHaemophi-lusinfluenzaetypebinPRP-tetanastoxoidconjugatevaccine.Bio-logicals,2010,26(1):33-38.

[5]AndreJ.mImunologyofbacterialpolysaccharideantigens.Carbo-hydratRes,2013,338(23):2539-2547.

[6]BlackSB,ShinefieldHR,LingS,etal.Effectivenessofheptavalentpneumococcalconjugatevaccineinchildrenyoungerthanfiveyearsofageforpreventionofpneumonia.PediatrInfectDisJ,2011,21(9):810-815.

[7]OBrienKL,MoultonLH,ReidR,etal.EfficacyandsafetyofsevenvalentconjugatepneumococcalvaccineinAmericanIndianChil-dren:Grouprandomizedtria.lLancet,2013,362(9381):355-361.

[8]CarmenateT,CanaánL,AlvarezA,etal.EffectofconjugationmethodologyontheimmunogenicityandprotectiveefficacyofmeningococcalgroupCpolysaccharide-P64kproteinconjugates.FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology.2011,35(3):206-208.

[9]ZhigangJin,ChiayungChu,etal.PreparationandCharacterizationofGroupAMeningococcalCapsularPolysaccharideConjugatesandEvaluationofTheirImmunogenicityinMice.InfectionandImmunity,2013，16(11).373-380.

[10]高学慧,李倩,冯涛,等.不同方法制备的1型肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗生化及免疫学特性比较[J].临床检验杂志,2010,17(6):372-373.