酶联免疫试剂盒检测的改进

酶联免疫试剂盒检测的改进

王诺耿红黄晶

王诺耿红黄晶

（中南民族大学生命科学学院湖北武汉430074）

【摘要】酶联免疫试剂盒是用于检测人或动物在疫苗注射后对机体是否产生效果的手段之一，它具有检测数量大、稳定性高、单价低廉等优点。但是，同时它也有检测时间长、检测步骤复杂、保存条件要求高等缺点。本实验室在综合考虑酶联免疫试剂盒的各项优缺点之后，对检测人体的几种酶联免疫试剂盒从其硬件设备、反应条件、试剂成分等各方面入手，对其检测进行改进，以期为酶联免疫试剂盒检测降低成本、节约时间、简化操作、提高检测率作出一些贡献。

【关键词】酶联免疫ELISA疫苗检测改进

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）13-0025-02

人体或动物在注射疫苗之后，是否产生了相应的抗体是衡量疫苗是否生效的重要指标。其检测手段主要有酶联免疫法和胶体金试纸条法。胶体金试纸条法相比于酶联免疫试剂盒法具有快捷、准确、方便等优点，但是也有单价昂贵、单次检测数量少、稳定性差等劣势。酶联免疫试剂盒又叫ELISA试剂盒，是通过抗原抗体的特异性反应来吸附血清中可能由于注射疫苗而已经产生的抗体并在关联酶的催化下使加入的显色剂显色，从而检测出之前注射的疫苗是否有效。通常一个试剂盒可以检测93人份的血清，具有检测数量大，单价低廉等优点。

1ELISA试剂盒检测血样基本原理及步骤

通常情况下，已注射疫苗的患者会在一个月后前往当地疾控站抽取末梢血做疫苗效果检测。采集的血样放置在采血液中处在4度冷藏保存，待实验室检测之前再置于室温下平衡半小时。一般93人份的血清一同使用样品稀释液稀释100倍之后，按顺序加入96孔包被板中，与包被板内含的病毒抗原在37度反应一段时间，之后洗涤包被板使其中非抗体物质与板体分离，再加入酶标记的二抗，反应后结合在包被板上。最后加入显色底物在酶的催化之下反应，显出颜色[1]。由于酶量与血清中抗体的量呈现一定的比例，它在一定时间内催化显色剂显色将会形成不同的颜色深浅，与试剂盒自带的阳性抗体对照同步显色对比之后定量的分析出血清中的抗体含量，从而判断之前注射的疫苗是否已经产生作用。

2ELISA试剂盒检测改进的结果与讨论

使用ELISA试剂盒检测抗体的优势在于它的单次检测数量大、长时间放置后稳定性高，但是它也有检测时间长、检测工序复杂、易溶血出现假阳性等缺点[2]。因此，本实验室从这几方面入手，改进了若干流程，简化了步骤，以期提高检测效率，降低劳动成本。

2.1采血设备的改进通常疾控站使用采血针采集患者末梢血之后放入具编号的离心管保存，不仅放置时容易分散或拿错，而且检测时不方便摇匀和加样。本实验室使用实用新型专利采血盒，盒体具有对应包被板的8排12列共计96孔，孔间距能配合12头长排型移液枪一次性吸取一排12孔的血清，每一排的小孔设计有一条12个连在一起的塑料孔帽。每次采血时，护士可现场每取完12人次的血样即盖上一条孔帽防止已采血样的溅射和污染。在血清运输的过程中，每93人份的血液样品保存于一个方形采血盒内，多个采血盒可以整齐码放堆叠，不会出现散乱和颠倒。在实验室检测前，可轻微颠倒采血盒2次混匀93人的血样，随后拉开8条塑料孔帽，用12头排枪分8次取血样，分别注入对应的96空包被板孔内。另外，采血之前已将计算好的一定量的样品稀释液置于采血盒的每个孔之中，采血同时进行了现场血清样品的稀释，这样做一者省去了实验室再次专门去稀释样品的步骤，二者样稀添加物能保护血清，较保存在离心管中的纯血清能更长时间的运输而不变质，也能有效地防止溶血情况的发生，减少假阳性的出现[3]。溶血是指采集的血液中红细胞破裂，血红蛋白从细胞内逸出，与采血液混合的现象。发生溶血的血样发黑，检测结果将为假阳性，造成对应患者的真实检测结果不明。由于血样的运输条件限制，搬运过程中的摇晃，溶血现象在试剂盒检测之前就已经经常的出现。而使用新型采血盒之后，溶血现象大大降低，这一者是由于采血盒的规模固定了采血的痕量，使得血样相比于采血液要小得多，外部的震动通过采血液的缓冲作用对包裹在内的血样影响减小；二者是由于样品稀释液的直接保护，使稀释100倍后的血样中红血球细胞膜在样稀的保护下很少与其他物质发生碰撞，甚至直接被保护基团包裹，难以破裂。

2.2反应时间及条件的改进在酶联免疫试剂盒检测的过程中，有两个步骤十分的关键。一个是，血清中抗体与包被板抗原的反应，另一个是酶联抗体与抗原抗体复合物的反应。通常在检测过程中，这两步反应都要在37度的水浴锅中温浴半小时。其中，第一步反应更为的关键，一者是血样中的抗体相比于包被板中抗原的要小很多，过量的抗原理应全部吸收血样中的抗体；二者是血清抗体是人类个体产生的，具有差异性，有些抗体基团亲和力强，而另外一些较弱，由反应动力学，弱亲和力基团进行一小时的反应方能保证反应完全。因此，本实验室对于第一步反应在水浴时间上做出了改动，由原有的半小时水浴增加到一个小时。实验结果表明，水浴的前半个小时里，水浴时间越长，结果越明显，颜色深浅的读数与时间长短呈指数分布；而水浴半小时后到一小时里，水浴时间越长，结果读数依然有所上升，但是上升缓慢，呈直线趋势，并且斜率很低；水浴一小时之后，最后读数与时间长短没有明显的关联。另外，使用水浴锅进行反应不适合大批量的检测，一则水浴锅容积有限，二则大量的包被板在水浴锅内互相漂浮挤压容易受热不均。因此，本实验室在做大批量检测实验时，使用恒温烘箱作为反应场所。干燥的恒温烘箱设置在37度时，能容纳更多的包被板同时反应，又能合理的叠放而不造成滑动。实验表明，放置于恒温烤箱中反应的包被板最终结果上略小于水浴锅反应的结果，并且烤箱发热管附近的包被板结果要比放置在其它地方的好，这可能是发热管附近温度最贴近于37度造成的。但是大多数烤箱中叠放的包被板结果相比于水浴锅中反应的结果都没有太大的差异。

2.3显色剂合二为一的改进显色反应时，两种显色底物在具有不同酶浓度的包被板中被催化反应显色，由于酶联抗体在包被板各孔的吸附率不同，导致对应的酶浓度在相同的时间条件下，能对相同的过量的反应底物产生不同的催化能力，从而最终导致底物显色反应的不同颜色深浅。由于两种颜色反应底物在接触后会缓慢反应，时间久了将会失效，因此，市场上大多数酶联免疫试剂盒的颜色反应底物都分开包装，称之为“底物液A”和“底物液B”。检测时，才先后加入相同量的A,B液于包被板中反应。本实验室使用乙酰胺作为钝化剂，直接将AB液混合，使它们在一起极为缓慢的反应，此物质作为显色剂。直到加入酶联抗体之后，受其中酶的催化，反应加快，显色。实验结果表明，乙酰胺做钝化剂效果良好，AB液混合之后在避光低温条件下能一个月不变色。而与传统的现场混合AB液的结果相比较，最终颜色读数要低，颜色指数大概是AB液分开使用颜色深度的四分之一。这可能是由于钝化剂依然在起作用，酶的催化能力被抵消一部分。

3结论

采血时使用新型采血盒不仅有利于护士取血方便，运输时叠放整齐，实验室检测时操作容易，更能有效的防止溶血现象的产生，减少假阳性的出现，降低复样率和重新抽血检测的可能性。

血清抗体与包被板抗原的反应是所有反应中最重要的一步，原本的半小时反应时间能使血清中的绝大多数抗体被包被板吸附，但是依然需要多用半小时反应使得其中的抗体被完全吸附，这可能是因为血清中抗体是由人类个体产生的，差异性较大，一小时的反应时间能更有效的得出最贴近真实的结果。另外，大批量检测血清样本时，可以使用恒温烤箱反应代替水浴锅，既能增加同时反应包被板数量，又对最后的结果造成的差别不大，并且烤箱发热管附近放置包被板效果最好。

传统的AB液直接混合后逐渐反应变色，加入乙酰胺作为钝化剂之后能保证长时间的极缓慢反应不变色。以这种AB混液作为显色剂之后，相比于原本结果有最终读数的降低，这可能是因为钝化剂抵消了酶的一部分作用。因此，为了实验结果更加明显，寻找新的钝化剂来保证放置时底物液极缓的反应并且加酶之后反应加快如初仍然需要更多尝试。

参考文献

[1]潘殊男,杨冰,董小曼,沈淑琴,栗妍,王晋.牛血清蛋白酶联免疫试剂盒性能的验证[J].微生物学免疫学进展2008,36.

[2]滕海英；余邹邱.石杉碱甲快速检测酶联免疫试剂盒的制备[J].中国免疫学杂志2014.

[3]王莉莉；朱.全自动酶联免疫检测仪与手工酶联免疫检测的比对评价[J].检验医学与临床2014.