黄芩提取物抗登革病毒Ⅱ型的体外实验研究

黄芩提取物抗登革病毒Ⅱ型的体外实验研究

洪文艳唐博恒刘金华刘建伟王珊珊方美玉

洪文艳唐博恒刘金华刘建伟王珊珊方美玉（广州军区疾病预防控制中心疾病监控科51050）

【摘要】本实验以白纹伊蚊C6/36细胞为宿主细胞，阿昔洛韦为阳性对照药物，通过观察细胞病变效应(CPE)和改良MTT法来测定一种黄芩提取物的细胞毒性、药物对DENV-Ⅱ的直接灭活作用、以及药物抗DENV-Ⅱ对细胞的吸附和对DENV-Ⅱ在细胞内复制增殖的抑制，并算出药物抗DENV-Ⅱ的治疗指数。实验结果显示该药物在体外细胞模型中对DENV-Ⅱ无直接灭活作用，最大无毒浓度为4.0mg/ml，半数中毒浓度TC50为20.1mg/ml，也基本无抗DENV-Ⅱ吸附细胞的作用，在达一定药物浓度时能抑制DENV-Ⅱ在细胞内的复制增殖，半数有效浓度IC50为4.0mg/ml，治疗指数约为5。

【关键词】黄芩；抗病毒作用；登革病毒Ⅱ型；体外实验

黄芩是一味临床常用的中药，中医认为黄芩味苦、性寒，归肺、心、胆、肝、胃、大肠经；具有清热燥湿，泻火解毒，止血等功效；主治湿热内蕴，呕吐，热淋，肺热咳嗽咯痰，痈肿疔疮等。近年来随着对其活性成分黄芩苷及黄芩素的深入研究，发现黄芩根提取物尤其是黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛、抗氧化及清除氧自由基等作用。在我国南方包括广东广西海南等地流行的登革病毒感染性疾病的临床治疗中也会用到双黄连口服液、银黄注射液等含有黄芩的中药制剂[1,2]。本实验就是基于上述基础，试图通过体外细胞实验模型对有关黄芩提取物抗登革病毒感染的治疗作用及机理进行研究。

1实验材料

1.1黄芩提取物

由武汉大学医学院病毒研究所提供，生药液浓度为200mg/mL，抽滤除菌后-20℃保存，实验用时以细胞维持液稀释成不同应用浓度。

1.2白纹伊蚊C6/36细胞

本实验室传代保存。细胞生长液：DMEM培养基加10%新生小牛血清，常规加100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素，1%谷氨酰胺。细胞维持液：除血清降为2%外其余同生长液。

1.3DENV-Ⅱ标准毒株

由本实验室保存。病毒经C6/36细胞活化增殖,细胞病变效应(cytopathogeniceffect;CPE)达+++以上时收获。实验测得其TCID50约为10–6。

2实验方法

2.1药物的细胞毒性测定

将细胞接种96孔板，置30℃、5%CO2培养箱中培养，长满成单层后弃上清，换用含药维持液继续培养。药液浓度依次为1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0mg/mL，每浓度重复3孔，同时设正常细胞对照及阳性药物对照（ACV,1.0ug/ml)。逐日观察CPE并记录，记录按通用标准：-：无细胞病变；+：25%以下的细胞出现病变；++：25%～50%的细胞出现病变；+++：50%～75%的细胞出现病变；++++：75%～100%的细胞出现病变。待各组CPE稳定（约5～7天）后用改良MTT法检测各孔细胞存活率。改良MTT法操作步骤参照文献[3]：每孔加入MTT（5mg/mL）20ul，30℃继续培养4h，后轻吸弃各孔内上清，每孔加入150ulDMSO，振荡混匀10分钟，使结晶充分溶解，测定570nm波长处吸光值(OD570)。细胞存活率(%)=药物组的OD值/正常细胞组OD值×100%，并用直线回归法算出药物对细胞的50%毒性浓度(TC50)。

2.2药物对病毒的直接灭活作用

将100TCID50的病毒液与药液等体积混合，药物终浓度在已测得的最大耐受浓度以内，分别为0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mg/mL，每浓度重复3孔,在CO2培养箱中于30℃下温育2h后，将3份同浓度样品混匀，用维持液进行连续10倍的递次稀释，按参考文献[4]方法测定病毒的TCID50。

2.3药物对病毒吸附细胞的阻断作用

待96孔板内的细胞长满成单层后，弃上清，加含药维持液0.1ml/孔，药物终浓度同2.1，每浓度重复3孔，同时设未用药的病毒对照及正常细胞对照。培养24h后弃上清，用PBS洗细胞1次，再接种100TCID50病毒0.1ml/孔,30℃吸附2h，再弃上清，换维持液继续培养细胞。每日观察CPE并记录。

2.4药物对病毒在细胞内复制增殖的抑制作用

待96孔板内的细胞长满成单层后，弃上清，100TCID50病毒0.1ml/孔，30℃吸附2h，再弃上清，换用不同浓度含药维持液。药物终浓度在半数中毒浓度以内，分别为0.5，1，2，4，8，16mg/mL。每浓度重复3孔，同时设阳性药物对照（ACV组,1.0ug/ml)、未用药液的病毒对照及正常细胞对照。待病毒对照组CPE达+++时用改良MTT法测各孔活细胞的含量，操作同2.1。算出病毒抑制率，病毒抑制率%=(药物组OD值-病毒对照组的OD值)/(正常细胞对照组的OD值-病毒对照组的OD值)×100%。并用直线回归法计算药物对DENV-Ⅱ在细胞内复制增殖的50%抑制浓度(IC50)和药物治疗指数(TI=TC50/IC50)。

3结果及讨论

3.1测得黄芩制剂对C6/36细胞具有一定毒性作用

如下表1所示，细胞对药物的最大耐受浓度约为2.0mg/ml，半数中毒浓度(TC50)为21.7mg/ml。

3.2不同浓度药物组的病毒TCID50值

见表2，与未用药的病毒对照组无明显差异。说明药物在细胞耐受浓度范围内对DENV-Ⅱ无直接灭活作用。

3.3药物抗病毒吸附细胞实验的CPE观察结果

见表3，各用药组与病毒对照组的CPE记录无差别，说明最大无毒浓度内的各浓度用药组对登革病毒吸附细胞的过程均无阻断作用。

3.4受试药物对病毒合成增值的抑制实验结果如下表4。

数据显示随着用药浓度的增加，对病毒增值的抑制率也提高，说明药物能抑制该病毒在细胞内的生物合成，且作用效果与用药剂量呈正相关的剂量效应依赖性。计算得其IC50为13.56mg/mL，治疗指数TI为1.6，根据治疗指数在2以内为抵消药物的标准，认为该受试药物在体外实验模型中对登革病毒感染仅有轻微的治疗作用。

参考文献

[1]胡世林,冯学锋.黄芩研究的某些新进展[J].中国药学杂志,2001,36(11):728-731.

[2]陈美娟,葛李,刘明华,等.银黄注射液体外抗病毒作用研究[J].中成药,2007,29(4):583.

[3]张建华,田志刚.MTT比色法测定细胞毒效应的应用进展[J].国外医学肿瘤学分册,1997,24:196-201.

[4]戴化生.新实验病毒学[M].北京:中国学术出版社,1983.