间充质干细胞的细胞粘附功能和移植的生存率对细胞移植治疗的影响

间充质干细胞的细胞粘附功能和移植的生存率对细胞移植治疗的影响

贺晶1骆雷鸣2刘宏斌2

1解放军总医院南楼临床部综合外科100853；2解放军总医院南楼临床部心内科100853

间充质干细胞（MSCs），由于其具有自我更新能力和广泛的分化潜能，被用于受损组织的修复治疗。前期临床研究中MSC的治疗潜力已被证明，但目前仍存在问题尚未得到解决。MSC在临床中的应用依赖于细胞的微环境以及细胞间黏附。恶劣的微环境和细胞粘附功能的丧失介导了凋亡的发生，影响MSCs在损伤部位的生存，从而影响MSCs的治疗效果。为了提高移植后MSCs的生存率，科学家们已经着手开发用来调节凋亡信号和增强细胞粘附的方法和途径，如预处理的细胞因子、生长因子以及抗凋亡的分子、遗传修饰、缺氧预处理等。MSC临床应用的成功还需要更合适的动物模型和对MSC治疗机制的更深入的研究及探索。本文主要介绍抑制细胞粘附功能缺失所导致的凋亡的相关方法，从而改善MSC的生存。

1、前言

再生医学，是指替换或再生受损的细胞、组织和器官，使其恢复正常的功能[1]。干细胞的研究提示其可用于治疗许多退行性疾病和与年龄有关的疾病。干细胞可分为胚胎干细胞（ESCs）及成体干细胞（ASCs），其中成体干细胞（ASCs）又被分为间充质干细胞（MSCs），造血干细胞（HSC），组织器官特异性干/祖细胞[3]，以及诱导多能干细胞（iPSCs）。诱导多能干细胞通过转录因子表达的遗传修饰作用，使体细胞分化成成具有多潜能能力的ESC样细胞[2]。尽管胚胎干细胞和iPSCs具有多分化潜能及数量较多等特点，在细胞治疗方面得到了广泛的生物医学应用，其临床应用仍面临许多问题，如伦理、免疫原性应答、低效、获得困难等[3]。

成体干细胞ASCs的使用没有伦理问题的制约[4]，因此，ASC成为干细胞治疗中的又一生力军。在不同类型的ASC中，间充质干细胞MSC因其容易分离及扩增的高效率性等特点，引起学者们的广泛关注。MSC可以相对容易地从骨髓，脂肪组织，滑膜，骨膜，牙齿，和胎盘[4]等组织中分离。此外，MSC不仅具有在规定的环境条件下分化成各种细胞谱系的能力，还表现出免疫抑制作用，可用于异体移植[6]。Devine等学者完成的研究表明，同种异体MSCs移植并未受到排斥，并且其移植的结果与非人灵长类动物实验中的同体移植（自体来源的）MSC的结果相类似。因此，MSC将广泛用于临床治疗试验的研究，许多前期的临床研究已经证实了MSC的治疗应用价值。仅2011年一年，正在进行之中的有关于MSC的临床试验就有百余项。这些临床研究表明MSC可用于多种疾病的治疗，包括严重的移植物抗宿主病（GVHD），严重的成骨不全，异染性的脑白质营养不良（MLD）和胡尔勒综合征（MPS-1H），以及心脏的慢性损伤的治疗。

目前MSC对疾病治疗的研究仍存在一些障碍，例如，由于给药部位的细胞凋亡及坏死，导致MSC自我更新能力的下降和生存率的降低。损伤部位的细胞附着于细胞外基质（ECM）的贴壁依赖性缺失而导致的程序性细胞死亡，从而影响移植MSC的生存。因此，改善细胞粘附功能成为提高MSC的生存率的研究热点。目前的研究多集中在通过抑制凋亡来增强移植的MSC的细胞间粘附和生存[7]。

2、移植MSC的再生机制

虽然移植的MSC在受损伤的组织再生的机制尚未完全明确；但一些相关研究表明其可能的机制包括细胞融合，分化和旁分泌作用。细胞融合的发生率较低，可分为两种类型：同型和异型细胞融合。干细胞融合属于异型融合，其产生的干细胞具有现有细胞的成熟表型，并可嵌入宿主细胞以增加细胞功能。体外和体内实验证据表明，MSC可以分化成不同的细胞类型，包括骨细胞，软骨细胞，心肌细胞，肝细胞和神经元谱系细胞。目前，MSCs的旁分泌功能被认为是通过分泌各种细胞因子和生长因子来完成的，包括血管内皮生长因子（VEGF），成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），胰岛素生长因子-1（IGF的分泌-1），肝细胞生长因子（HGF），转化生长因子（TGF-）β1，前列腺素E2，和骨形态发生蛋白-2（BMP-2）。这些因子都对MSC和宿主细胞有广泛的生物学功能，包括免疫调节作用，促进血管形成，抗细胞凋亡，抗氧化作用，以及活化静态干细胞，使其分化和增殖等。此外，MSC来源的微泡，也显示出上所述的相似的生物学功能，关于MSCs的旁分泌假说认为：MSCs的治疗潜力完全依赖于分泌功能，它分泌的微泡也是其中一种。试验证明MSCs可能通过旁分泌作用使受损组织或器官再生。

3、移植部位MSC死亡的原因

由于恶劣的环境条件，以及凋亡和炎症的发生，移植的MSC面临着细胞死亡的威胁。MSC具有成纤维细胞形态，并且可附着在培养板上，最初的研究集中在如何获取移植所需的MSC，在这个过程中MSC的活性的已经降低。活性受损的MSC注射到受损的组织或器官，恶劣的微环境、细胞和基质之间不合适的结构的存在极易激活的MSC的凋亡信号。组织或器官的受损是许多疾病病理生理本质，活性氧（ROS）和抗氧化机制[8]之间的失衡产生了氧化应激反应。其对移植的MSC影响巨大，从而介导了细胞凋亡的发生[9]。炎症反应也会诱发氧化应激反应，适当的炎症反应会募集促进血管生成因子和祖细胞，然而，慢性炎症却抑制细胞因子的募集、影响祖细胞和移植MSC的生存。以中性粒细胞，单核细胞和巨噬细胞为代表的炎症因子可趋化相关的细胞因子，生成活性氧，从而诱导细胞凋亡并灭活细胞保护剂一氧化氮（NO）。

在过去的几年里，经过遗传修饰的离体MSCs被证明可以降低上述局限性。遗传修饰可以提高移植MSCs的存活、增殖，以及移植MSC的直接分化能力。此外，用生物活性分子预处理的方法也可以增强MSC的分泌功能，从而提高移植MSCs的治疗效果。

4、MSC治疗潜力的提高

目前的研究已展开多种方法用来克解决细胞的生存率低等问题。包括生长因子或细胞因子等生物活性因子的预处理，缺氧预处理以及基因修饰过表达抗凋亡或粘连信号等。

4.1生物活性因子预处理。

近年来研究的目的主要围绕如何改进植入的MSCs的生物学效能。例如，IGF-1预处理后小鼠的MSCs高表达connexin-43，使其具有通过间隙连接通讯功能发挥抗凋亡、细胞增殖和分化的功能，并重启细胞重编程。经细胞衍生因子-1（SDF-1）预处理也可以抑制细胞凋亡，提高细胞的存活及增殖，并改善心肌功能。大鼠MSCs转染热休克蛋白70后，与天然MSC相比，表现出对缺氧诱导的细胞凋亡和心肌纤维化的保护作用。

正常氧及缺氧条件下动物模型体内和体外实验的研表明：缺氧预处理能刺激MSCs的活性，分泌包括血管内皮生成因子、肝细胞生长因子等细胞因子，提高细胞生存能力、上调促血管生成蛋白质的表达，从而增加血管的生成和功能的恢复。经缺氧预处理后的MSC植入创伤性脑损伤的大鼠模型的研究发现，其大鼠脑损伤的体积和细胞凋亡减少，运动、认知等功能和神经的形成均有所恢复。富血小板的血块释放物（PRCR）也可通过PDGFR-α/PI3K/AKT分化/NFκB信号传导途径增强大鼠MSC存活和增殖，促进软骨细胞和成骨的形成。

最近的研究表明，生物活性小分子和微小RNA也可增强MSC细胞的粘附。大鼠MSC被蛋白激酶C的活化剂（PKC），phorbol12-myristate13-acetate（PMA）预处理后，增加了细胞粘附，减少了细胞脱离，而PKC抑制剂rottlerin的治疗则导致细胞粘附减少。

此外，PMA预处理的MSCs注射受损大鼠心脏，其成活率提高，梗塞尺寸、纤维化面积和凋亡细胞的数目减少，心脏功能得到改善。阿托伐他汀预处理的MSCs可以通过eNOS/NO系统改善植入后存活率并增强心脏功能；褪黑激素预处理的大鼠MSCs表现出通过激活大鼠脑内ERK信号通路从而增加移植后存活率，降低脑梗塞的能力。Yu等学者基于微小RNA排列的研究表明，微小RNA-125b的在保护细胞-基质间的粘附和通过增加ERK磷酸化和抑制p53的表达抑止凋亡中起到关键的作用。另外，微小RNA-1转染的小鼠的MSCs表现出细胞的存活增加、诱导心肌细胞的分化，诱导心肌梗死之后心脏功能的的恢复等能力。

4.2。遗传修饰增加抗凋亡能力。

为增强MSC的抗凋亡信号传导的能力，许多研究都集中在与细胞凋亡和抗凋亡蛋白以及其级联反应等方面。Toll样受体4（TLR4），G蛋白偶联受体，在缺氧条件下激活凋亡信号，而PI3K，AKT和ERK信号通路的激活在提高细胞存活方面有显著的作用。TLR4基因敲除鼠的MSC，其存活率有所提高。在对大鼠心脏局部缺血/再灌注模型的研究表明，通过STAT3的活化，TLR4基因敲除的MSC能分泌更多的VEGF，HGF，和IGF-1。Mangi及其同事在对啮齿动物心肌梗死模型的研究中发现，体外逆转录病毒转导的AKT过表达的大鼠MSC可以抗细胞凋亡，并改善心脏功能。MSC转导Hsp-27后，半胱氨酸蛋白酶级联作用失活，导致MSC在心肌梗死鼠模型中的存活率增加。另外，热休克蛋白20可正向调节氧化应激反应，Hsp-20修饰的MSCs表现出的结果类似于热休克蛋白27，两者均可激活AKT、分泌生长因子（VEGF，FGF-2和IGF-1）等。大鼠MSC转染抗凋亡基因Bcl-2后，可降低细胞死亡率、促进血管生成因子VEGF的分泌。Fan等人研究表明，经过生存素（细胞凋亡蛋白家族（IAP）的抑制剂）转染的大鼠MSC移植在中风和心肌梗死]模型中可提高其存活率，并表现出较好的治疗效果。

趋化因子及其受体在造血干细胞的归巢，趋化和粘附中也起到重要作用。将转导了趋化因子小鼠的MSCs移植在受损心肌中也可提高植入率和存活率。

4.3遗传修饰增强细胞粘附。

移植MSC的细胞粘附是细胞植入和组织器官再生的重要因素，而移植的MSC的粘附功能的缺失则导致凋亡的发生。影响ECM相互作用的整合素，与影响细胞与细胞、细胞与基质相互作用的连接蛋白（CXS），均与干细胞存活和增殖相关联。为了减少凋亡的发生，增加细胞间的粘附，改善植入MSC的存活率，细胞附着分子的调节可能成为重要的研究热点。

Copland等人运用基因芯片和蛋白质组筛选发现在缺氧条件下小鼠和人MSC的纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）高表达。与野生型干细胞相比，经PAI-1基因敲除小鼠中分离得到的MSC，较移植后存活率和粘附性均增强。这些结果表明，PAI-1可通过降低细胞间的粘附介导凋亡的发生。

tTG作为整合素的辅助受体参与纤连蛋白（FN）的细胞粘附。tTG在大鼠MSC中的高表达，可通过形成的粘着复合物和粘着斑相关激酶包括粘着斑激酶（FAK），Src蛋白和PI3K的磷酸化的增加，增强细胞附着和迁移。此外，tTG转染的MSC植入大鼠心肌梗死模型，可恢复心脏功能。此外，由整合素调节的FAK的激活，可以抑制凋亡的发生。细胞间和细胞与基质间的粘附可被ROS阻断，这与MSC移植微环境中的粘着斑相关分子（如磷酸化FAK，Src蛋白，和αVβ1整联）的水平的降低相关。

整合素连接激酶（ILK）也可加强缺氧环境下大鼠缺血心肌中的MSC细胞的粘附。ILK的是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其与β1整合素的胞质域相互作用并介导整合素的细胞粘附信号的表达。有研究表明，使用慢病毒载体转染ILK的MSC，能增强细胞存活和粘附、防止凋亡的发生。研究还提示ILK增加的ERK和AKT的磷酸化，参与了对粘附介导的细胞存活的调节，同时也增加了的Bcl-2/Bax比值、抑制caspase-3的活化。ILK转导的MSCs移植到心肌梗死大鼠，可减少梗死面积、减低凋亡信号以及纤维化的形成，并改善微血管密度。

总之，这些研究表明，体外MSC的遗传信息的修饰，可以通过增强细胞存活和粘附发挥其治疗效力。此外，通过基因修饰提高附着力和MSC的迁移的移植MSC可用于疾病的全身治疗。例如，MSC作为药物递送载体已用于癌症的治疗[10]。在这样的应用中，MSC的适当修饰可以提高迁移能力以及MSCs对靶组织的整合，增加治疗的功效。因此，增强细胞粘附能力可能对于MSC的治疗效果具有相当大的积极影响。

5.结论和未来的思考

MSC的因其自我更新和分化的能力，已广泛用于受损组织的修复与再生。许多临床前期和临床试验研究表明，MSC疗法是安全和有效的。然而，MSC治疗因其移植后的较低的生存率，和因凋亡所介导的细胞死亡，严重影响了移植MSC的生物学活性的发挥。为了提高移植的MSC的存活和细胞粘附，科学家们进行了大量的试验及研究，其中包括生长因子或细胞因子预处理，缺氧预处理，和遗传修饰以诱导抗凋亡信号传导或粘附分子的表达等方向。这些方法确保了MSC在修复受损的组织中的治疗效果。MSCs广阔应用依赖于其再生的机制的明确，其所分泌的细胞因子的确切作用，经过预处理后其安全性，给药途径，和MSCs的注入量等方面仍未明确，而MSC的储存和分化条件也需要进一步的研究。因此，对未知领域的研究有助于干细胞疗法的改进。优化、规范、可控的外源性MSC的输注方法也正在研发中，相关的前期临床实验和临床研究将有助于阐明微环境对干细胞活性和修复机制的影响，这将促进MSC作为再生药物的成功应用。

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