1.广东省深圳市宝安区中心医院深圳5181022.第三军医大学附属新桥医院重庆400037
[关键词]:大鼠;腺病毒;心肌营养素;脊髓损伤;修复
本研究用大鼠C3脊髓外侧索横切模型,腺病毒载体直接注射,观察心肌营养素-1(CT-1)对红核神经元的存活、红核脊髓束轴突再生和前肢功能恢复的影响。
1.材料与方法
1.1实验动物及分组
成年Wistar雌性大鼠,体重180-240g(大坪医院动物室提供)。随机分为5组:正常组(N):正常动物;损伤组(GF):SCI+明胶海绵(gelfoam)+病毒缓冲液;病毒对照组(Adv-eGFP):SCI+明胶海绵+Adv-Egfp;Adv-CT1组(Adv-CT1):SCI+明胶海绵+Adv-CT1。每组动物在1、4、8周Fluord-Gold(FG)(Fluorochrome,Inc.)观察神经元存活,4周Dextran,Biotin,10,000MW,lysinefixable(BDA-10,000)(MolecularProbes,D-1956)观察轴突再生,2、3、4周观察动物行为学,每个时间点4只动物。
1.2动物手术及观察
C3脊髓外侧索横切模型(C3Hx):常规麻醉和暴露颈段脊髓,用微型锐利刀片C3脊髓背根下方2mm垂直切下,并切除2-3mm,形成约1×2mm2大小的空洞。这种切除范围包括整个外侧索(包含红核脊髓束)、部分腹侧索和前后角部分灰质,背侧索完整。
给药方式:病毒组:纯化病毒用10mmTris.HCl(pH7.4)稀释至107pfu/ml,用约5-10ul病毒液饱和明胶海绵,植入空洞。对照组:直接放入5-10ul10mmTris.HCl饱和的明胶海绵。CT-1组:CT-1100ug/ml饱和明胶海绵,放入空洞5min,取出15min后放入重新CT-1饱和明胶海绵,重复3次,最后再放入CT-1饱和明胶海绵。8-0丝线缝合硬脊膜,关闭伤口。术后肌肉20万U青霉素注射,分笼喂养。
FG注射:动物取材前3d,动物重新麻醉。再生观察组暴露双侧C5外侧索,2%FG1ul微电极(成茂会社,日本)缓慢注入。存活观察组暴露双侧C2外侧索,并分别注入1ul2%FG。关闭伤口,3d后取材。脑桥冠状面30m冰冻切片(CM1900,Leica),红核长度大约1000m,共30张切片左右,按顺序置于栽玻片上。每张切片于荧光显微镜(MPS1063,Leica)下紫色激发荧光观察FG标记的红核神经元,每张每侧标记的神经元计数。为避免过度计数,每张切片计数2次,取平均数。只有能辨认神经元细胞核、核仁和细胞形态神经元才可计数。计数时采取相邻切片对照观察,避免神经元重复计数。显微镜放大倍数为100倍。
BDA注射:动物取材前15d,动物重新麻醉。动物置于立体定位仪(成茂会社,日本)上“零位”固定。切开颅顶皮肤,30%H2O2置于颅骨氧化颅骨缝,辩认前卤,牙科转颅骨开窗。微电极推进器(成茂会社,日本)控制玻璃尖端直径50um的微电极。右侧红核定位:Bregma点向后5.8mm,向外侧0.7mm,距颅骨深为7.4mm(PaxinosG.Theratbraininsterotaxiccoordinates.Academicpress)。微电极缓慢刺入红核。注射参数:阳性脉冲直流电5uA,频率为注射7s后停7s;时间为30min,0.5ul10%BDA。关闭伤口,分笼喂养,15d后取材。脑切片30um,脊髓切片25um。按BDA试剂盒说明行BDA免疫组华染色。
1.3行为学试验
所有动物采用前肢的不对称试验观察行为的改变。评分行为、评分内容、评分标准根据文献严格执行。每组动物在试验后2、3、4周评分,每只动物观察时间为:正常前肢+伤肢+双肢靠壁时间=5min。
1.4统计学处理
FG标记红核神经元计数用表示,行为学评分用正常前肢、伤肢、双肢靠壁时间的百分比表示。t-test检验两组间的差异。
2结果
2.1FG神经逆行示踪
(1)红核神经元存活计数SCI后在损伤区上一个节段双侧注射FG,FG逆行示踪标记的红核神经元作为神经元存活计数。发现双侧红核神经元均标记。在损伤后1-4周,标记红核神经元数几乎无变化。损伤后8周,损伤组、CT-1组、Adv-eGFP组、Adv-CT1组标记神经元分别减少31%、29%、32%、19%。Adv-CT1组与损伤组相比,有显著性差异(P<0.05)。Adv-CT1明显支持红核神经元的存活(表1)。
2.2BDA神经顺行示踪
损伤4周后,脊髓作损伤上区、损伤区和损伤下区的横切片观察BDA标记的轴突。损伤上区,正常组、治疗组和对照组均有大量标记的轴突,数目依次减少。在损伤区,由于RST处空洞没有被完全充填,治疗组和对照组在白质内未见标记的轴突,但在后角可见散在的BDA标记。在损伤下区,治疗组在白质和后角可见散在的BDA标记,对照组仅在后角可见散在的BDA标记(Fig.4)。轴突计数,正常组大约为150个;病毒对照组(Adv-eGFP)分别为(6±1)个;而病毒治疗组(Adv-CT1)为(17±2)个,与Adv-eGFP相比明显Adv-CT1促进轴突再生(P<0.05)。
2.3行为学分析
将大鼠置于玻璃圆柱缸内,正常大鼠大约50%时间单肢靠壁,50%时间双肢靠壁。上颈髓外侧索横切后,大鼠双肢使用明显不对称,伤肢(左肢)使用明显减少。2周后,治疗组和对照组开始使用伤肢和双肢,但治疗组持续使用伤肢和双肢的时间增加较多,表明有功能恢复或代偿。3周后,治疗组大鼠约4%的时间使用伤肢,而对照组仅(1.3%)使用伤肢。4周后,治疗组约有9%的时间使用伤肢,而对照组仅4%使用伤肢。经统计学处理,表明Adv-CT1能促进大鼠SCI后运动功能恢复(P<0.05)(表3)。
3讨论
3.1SCI后红核神经元存活
SCI后红核神经元存在迟发性损伤。SCI后1-4周红核神经元的数量一直稳定,未见明显降低[1]。但在5-8周出现明显的降低,25-40%的神经元死亡或萎缩。本实验发现在伤后1-4周,红核神经元的数目下降不明显,而且数目稳定。而在伤后8周,红核神经元30%左右的神经元未标记。CT-1支持红核神经元的存活。SCI后4-8周在伤区提供CNTF,能阻止红核神经元死亡[1]。即使在SCI后1年,向脑内向红核提供神经营养因子,也可使萎缩的神经元逆转存活,并促进神经元再生。本实验在脊髓损伤区提供CT-1发现,在损伤后C3Hx1-4周,标记红核神经元下降不明显。损伤后8周,损伤组、CT-1组、Adv-eGFP组标记神经元的数目分别减少31%、29%、32%。这种变化特点与文献报道一致。损伤后1-4周,红核神经元变化虽然不多,存活神经元的数目Adv-CT1组高于损伤组,表明CT-1在急性期可挽救神经元的存活。损伤后8周,Adv-CT1组神经元存活率为89%,损伤组仅为69%。与损伤组相比,明显支持红核神经元的存活(P<0.05),表明CT-1支持红核神经元的存活。
3.2脊髓RST再生
直接提供NTs、invivo基因治疗和exvivo基因治疗促进轴突再生。本实验中在损伤下区注射FG,Adv-CT1组标记的红核神经元为1.2%,明显多于对照组(0.4%)(P<0.05)。RST的BDA顺行示踪,在损伤下区BDA标记的神经轴突也多于对照组。在损伤区治疗组和对照组均未见明显再生的轴突,有三种可能:1)切片未切及再生的轴突;2)CT-1无促进再生能力;3)没有细胞移植,胶质瘢痕可能抑制了CT-1的促再生作用。Adv-CT1组标记的红核神经元多于对照组,损伤上、下区BDA标记的神经元也多于对照组,表明CT-1治疗促进RST再生。其原因可能为CT-1挽救的存活红核神经元存在或重建了旁支通路和CT-1有较弱的促进RST再生的能力。与脊髓其他传导束相比,RST再生具有生长快(1-2mm/d)、生长距离可长达几公分能找到靶器、可生长入白质和成纤维细胞移植物的特点,表明RST对髓鞘的抑制并不敏感,这与CST不同,这种内在性的差别可能是RST再生能力较强的原因之一。CT-1治疗组损伤下区BDA顺行标记神经元轴突多于对照组,也说明CT-1组RST再生不是通过损伤区,而是可能通过向未损伤区白质或灰质再生。
3.3RST再生与功能恢复
本文行为学试验发现,3周后治疗组大鼠约4%的时间使用伤肢,4周后治疗组约9%的时间使用伤肢,均明显高于对照组(P<0.05)。说明CT-1有助于促进SCI功能的恢复。这与治疗组少量再生呈正相关,但不能完全确定是RST再生引起的功能恢复,本文认为可能还有以下一些原因:1)可能存在其他一些传导束的轴突再生,如中缝脊髓束、前庭脊髓束的再生;2)后根出芽介导的感觉功能恢复;3)节段神经环路的建立;4)CT-1挽救损伤区脊髓神经元存活,节段神经元功能恢复;5)CT-1挽救红核神经元存活,红核神经元功能恢复。
参考文献
[1]Karimi-AbdolrezaeeS,EftekharpourE,WangJ,SchutD,FehlingsMG.Synergisticeffectsoftransplantedadultneuralstem/progenitorcells.JNeurosci.2010;30(5):1657-76