腺病毒介导心肌营养素-1对成年大鼠脊髓损伤的修复作用

腺病毒介导心肌营养素-1对成年大鼠脊髓损伤的修复作用

李贵林[]王立胜1徐东明1张正丰2

1.广东省深圳市宝安区中心医院深圳5181022.第三军医大学附属新桥医院重庆400037

[关键词]：大鼠；腺病毒；心肌营养素；脊髓损伤；修复

本研究用大鼠C3脊髓外侧索横切模型，腺病毒载体直接注射，观察心肌营养素-1(CT-1)对红核神经元的存活、红核脊髓束轴突再生和前肢功能恢复的影响。

1.材料与方法

1.1实验动物及分组

成年Wistar雌性大鼠，体重180-240g(大坪医院动物室提供)。随机分为5组：正常组(N)：正常动物；损伤组(GF)：SCI+明胶海绵（gelfoam）+病毒缓冲液；病毒对照组(Adv-eGFP)：SCI+明胶海绵+Adv-Egfp；Adv-CT1组(Adv-CT1)：SCI+明胶海绵+Adv-CT1。每组动物在1、4、8周Fluord-Gold(FG)(Fluorochrome,Inc.)观察神经元存活，4周Dextran,Biotin,10,000MW,lysinefixable(BDA-10,000)(MolecularProbes,D-1956)观察轴突再生，2、3、4周观察动物行为学，每个时间点4只动物。

1.2动物手术及观察

C3脊髓外侧索横切模型(C3Hx)：常规麻醉和暴露颈段脊髓，用微型锐利刀片C3脊髓背根下方2mm垂直切下，并切除2-3mm，形成约1×2mm2大小的空洞。这种切除范围包括整个外侧索(包含红核脊髓束)、部分腹侧索和前后角部分灰质，背侧索完整。

给药方式：病毒组：纯化病毒用10mmTris.HCl(pH7.4)稀释至107pfu/ml，用约5-10ul病毒液饱和明胶海绵，植入空洞。对照组：直接放入5-10ul10mmTris.HCl饱和的明胶海绵。CT-1组：CT-1100ug/ml饱和明胶海绵，放入空洞5min，取出15min后放入重新CT-1饱和明胶海绵，重复3次，最后再放入CT-1饱和明胶海绵。8-0丝线缝合硬脊膜，关闭伤口。术后肌肉20万U青霉素注射，分笼喂养。

FG注射：动物取材前3d，动物重新麻醉。再生观察组暴露双侧C5外侧索，2%FG1ul微电极(成茂会社，日本)缓慢注入。存活观察组暴露双侧C2外侧索，并分别注入1ul2%FG。关闭伤口，3d后取材。脑桥冠状面30m冰冻切片(CM1900,Leica)，红核长度大约1000m，共30张切片左右，按顺序置于栽玻片上。每张切片于荧光显微镜(MPS1063,Leica)下紫色激发荧光观察FG标记的红核神经元，每张每侧标记的神经元计数。为避免过度计数，每张切片计数2次，取平均数。只有能辨认神经元细胞核、核仁和细胞形态神经元才可计数。计数时采取相邻切片对照观察，避免神经元重复计数。显微镜放大倍数为100倍。

BDA注射：动物取材前15d，动物重新麻醉。动物置于立体定位仪(成茂会社，日本)上“零位”固定。切开颅顶皮肤，30%H2O2置于颅骨氧化颅骨缝，辩认前卤，牙科转颅骨开窗。微电极推进器(成茂会社，日本)控制玻璃尖端直径50um的微电极。右侧红核定位：Bregma点向后5.8mm，向外侧0.7mm,距颅骨深为7.4mm(PaxinosG.Theratbraininsterotaxiccoordinates.Academicpress)。微电极缓慢刺入红核。注射参数：阳性脉冲直流电5uA,频率为注射7s后停7s；时间为30min,0.5ul10%BDA。关闭伤口，分笼喂养，15d后取材。脑切片30um，脊髓切片25um。按BDA试剂盒说明行BDA免疫组华染色。

1.3行为学试验

所有动物采用前肢的不对称试验观察行为的改变。评分行为、评分内容、评分标准根据文献严格执行。每组动物在试验后2、3、4周评分，每只动物观察时间为：正常前肢+伤肢+双肢靠壁时间=5min。

1.4统计学处理

FG标记红核神经元计数用表示，行为学评分用正常前肢、伤肢、双肢靠壁时间的百分比表示。t-test检验两组间的差异。

2结果

2.1FG神经逆行示踪

(1)红核神经元存活计数SCI后在损伤区上一个节段双侧注射FG，FG逆行示踪标记的红核神经元作为神经元存活计数。发现双侧红核神经元均标记。在损伤后1-4周，标记红核神经元数几乎无变化。损伤后8周，损伤组、CT-1组、Adv-eGFP组、Adv-CT1组标记神经元分别减少31%、29%、32%、19%。Adv-CT1组与损伤组相比，有显著性差异(P<0.05)。Adv-CT1明显支持红核神经元的存活(表1)。

2.2BDA神经顺行示踪

损伤4周后，脊髓作损伤上区、损伤区和损伤下区的横切片观察BDA标记的轴突。损伤上区，正常组、治疗组和对照组均有大量标记的轴突，数目依次减少。在损伤区，由于RST处空洞没有被完全充填，治疗组和对照组在白质内未见标记的轴突，但在后角可见散在的BDA标记。在损伤下区，治疗组在白质和后角可见散在的BDA标记，对照组仅在后角可见散在的BDA标记(Fig.4)。轴突计数，正常组大约为150个；病毒对照组（Adv-eGFP）分别为（6±1）个；而病毒治疗组（Adv-CT1）为（17±2）个，与Adv-eGFP相比明显Adv-CT1促进轴突再生(P<0.05)。

2.3行为学分析

将大鼠置于玻璃圆柱缸内，正常大鼠大约50%时间单肢靠壁，50%时间双肢靠壁。上颈髓外侧索横切后，大鼠双肢使用明显不对称，伤肢(左肢)使用明显减少。2周后，治疗组和对照组开始使用伤肢和双肢，但治疗组持续使用伤肢和双肢的时间增加较多，表明有功能恢复或代偿。3周后，治疗组大鼠约4%的时间使用伤肢，而对照组仅(1.3%)使用伤肢。4周后，治疗组约有9%的时间使用伤肢，而对照组仅4%使用伤肢。经统计学处理，表明Adv-CT1能促进大鼠SCI后运动功能恢复(P<0.05)(表3)。

3讨论

3.1SCI后红核神经元存活

SCI后红核神经元存在迟发性损伤。SCI后1-4周红核神经元的数量一直稳定，未见明显降低[1]。但在5-8周出现明显的降低，25-40%的神经元死亡或萎缩。本实验发现在伤后1-4周，红核神经元的数目下降不明显，而且数目稳定。而在伤后8周，红核神经元30%左右的神经元未标记。CT-1支持红核神经元的存活。SCI后4-8周在伤区提供CNTF，能阻止红核神经元死亡[1]。即使在SCI后1年，向脑内向红核提供神经营养因子，也可使萎缩的神经元逆转存活，并促进神经元再生。本实验在脊髓损伤区提供CT-1发现，在损伤后C3Hx1-4周，标记红核神经元下降不明显。损伤后8周，损伤组、CT-1组、Adv-eGFP组标记神经元的数目分别减少31%、29%、32%。这种变化特点与文献报道一致。损伤后1-4周，红核神经元变化虽然不多，存活神经元的数目Adv-CT1组高于损伤组，表明CT-1在急性期可挽救神经元的存活。损伤后8周，Adv-CT1组神经元存活率为89%，损伤组仅为69%。与损伤组相比，明显支持红核神经元的存活(P<0.05)，表明CT-1支持红核神经元的存活。

3.2脊髓RST再生

直接提供NTs、invivo基因治疗和exvivo基因治疗促进轴突再生。本实验中在损伤下区注射FG，Adv-CT1组标记的红核神经元为1.2%，明显多于对照组(0.4%)(P<0.05)。RST的BDA顺行示踪，在损伤下区BDA标记的神经轴突也多于对照组。在损伤区治疗组和对照组均未见明显再生的轴突，有三种可能：1)切片未切及再生的轴突；2)CT-1无促进再生能力；3)没有细胞移植，胶质瘢痕可能抑制了CT-1的促再生作用。Adv-CT1组标记的红核神经元多于对照组，损伤上、下区BDA标记的神经元也多于对照组，表明CT-1治疗促进RST再生。其原因可能为CT-1挽救的存活红核神经元存在或重建了旁支通路和CT-1有较弱的促进RST再生的能力。与脊髓其他传导束相比，RST再生具有生长快(1-2mm/d)、生长距离可长达几公分能找到靶器、可生长入白质和成纤维细胞移植物的特点，表明RST对髓鞘的抑制并不敏感，这与CST不同，这种内在性的差别可能是RST再生能力较强的原因之一。CT-1治疗组损伤下区BDA顺行标记神经元轴突多于对照组，也说明CT-1组RST再生不是通过损伤区，而是可能通过向未损伤区白质或灰质再生。

3.3RST再生与功能恢复

本文行为学试验发现，3周后治疗组大鼠约4%的时间使用伤肢，4周后治疗组约9%的时间使用伤肢，均明显高于对照组(P<0.05)。说明CT-1有助于促进SCI功能的恢复。这与治疗组少量再生呈正相关，但不能完全确定是RST再生引起的功能恢复，本文认为可能还有以下一些原因：1)可能存在其他一些传导束的轴突再生，如中缝脊髓束、前庭脊髓束的再生；2)后根出芽介导的感觉功能恢复；3)节段神经环路的建立；4)CT-1挽救损伤区脊髓神经元存活，节段神经元功能恢复；5)CT-1挽救红核神经元存活，红核神经元功能恢复。

参考文献

[1]Karimi-AbdolrezaeeS,EftekharpourE,WangJ,SchutD,FehlingsMG.Synergisticeffectsoftransplantedadultneuralstem/progenitorcells.JNeurosci.2010;30(5):1657-76