破伤风抗体(IgG)定量检测试剂盒（酶联免疫法）使用评价

破伤风抗体(IgG)定量检测试剂盒（酶联免疫法）使用评价

丰达星张珍英徐瑾郭万申

丰达星张珍英徐瑾郭万申（河南省疾病预防控制中心河南郑州450016）

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）46-0018-03

【摘要】目的应用破伤风抗体（IgG）定量检测试剂盒（酶联免疫法），对健康人群进行抗体水平检测，与标准法检测进行比较，评价试剂盒的灵敏度和特异性。方法根据试剂盒说明书，采用双盲法检测300份健康人血清，依照标准品绘制标准曲线，计算破伤风抗体浓度，通过与标准检测方法比较，计算敏感性、特异性、相关性等指标。结果通过检测标准品，计算线性回归方程y=7.7489x-0.0018，r=0.99，国产试剂敏感性为94.1%，特异性为96.8%，约登指数为0.909，阳性预测值为98.5%，阴性预测值为88.5%。相关性分析结果r=0.987798，P<0.05，标准法测定结果与国产试剂盒测定结果之间有显著的正相关。结论该国产试剂操作规范，简单快捷，不受条件限制，利于大量标本的快速检测，对该病的临床诊断、流行病调查，提供了一种更为简捷精确切实可行的检测手段。

【关键词】破伤风抗体酶联免疫吸附试验评价

EvaluationofEnzyme-linkedImmunosorbentAssaysforDetectionofIgGAntibodytoTetanus

【Abstract】ObjectiveTocomparetheperformanceofIgGELISAkitsfordetectionantibodytotetanus.Method300serumsamplesfromthehealthwerecheckedforIgGantibodybydouble-blindmethodwiththeELISAkits.Resultofthe300samples,thesensitivity,specificity,Youden’sindexofkitwas94.1%,96.8%and0.909respectively.Bythecorrelationanalysis,theresultsfrom2methodswerepositivecorrelation（r=0.987798,P<0.05）.ConclusionTheprotocolofkitwaseasy,andtheresultwasreliable.Itcouldbeusedasaroutinemethodforscreeninghumanantibodyfortetanustoxoid.

【Keywords】tetanusantibodyELISAevaluation

破伤风感染是一种危害人民健康的传染病之一，破伤风抗毒素可使机体产生被动保护免疫力，以达到预防和治疗的目的。

目前，应用于破伤风抗体的检测主要采用血凝法（HA）进行破伤风抗体水平的半定量检测。此方法操作复杂、耗时长、灵敏度低，不适宜大量标本的检测，而酶联免疫吸附试验特异性强，重复性好，具有简便、灵敏、迅速、同时测定大量样品等特点，一般用于定性检测，只有在有标准品并能够绘制标准曲线时用于半定量测定。目前已有商业化试剂，绝大部分只是定性检测，极少有试剂进行定量检测。本次研究应用破伤风抗体（IgG）定量检测试剂盒，对健康人群进行抗体水平检测，与标准法检测进行比较，评价试剂盒的灵敏度，特异性。

1材料和方法

1.1材料

检测标本来源于健康人群，所有参与者抽取静脉血3ml，静置凝固后，分离血清，随机抽取300份，-20℃保存备检。

1.2试剂和仪器

所用试剂为郑州亿特生物技术有限公司研制的破伤风抗体（IgG）定量ELISA检测试剂盒（简称国产试剂），批准文号：[国食药监（准）字2011第3400138号]，批号：20091101。实验过程中洗板采用全自动洗板机（Autoinstruments.Inc）洗板，在EL-800型酶标仪（Bio-tekinstruments.Inc）上读取及采集数据。

1.3检测方法

参照试剂说明书检测之前将试剂放在室温平衡30分钟，然后1:100稀释待检标本，加入待检标本和标准品，经过孵育，加入酶标抗体，再经过显色及终止的过程，完成试验，对空白对照调零，用酶标仪在450±2nm波长处测定吸光值（OD值），要求终止后10分钟内完成判读。以标准品的含量为自变量（X），以其对应的OD值为因变量（Y），求出线性回归方程，将待检样品的吸光值代入回归方程，计算出相应的含量，当线性回归系数r≤0.98时，视为无效，有效线性范围为0.00-0.16IU/ml，如果待检样品破伤风抗体（IgG）含量高于0.16IU/ml时，无法准确定量，需用试剂盒中的样品稀释液作进一步稀释后重新检测，检测结果须再乘以稀释倍数。

1.4统计分析

应用SPSS17.0统计软件，对该试剂检测得到的抗体水平，与标准检测法得到的抗体水平进行比较，计算该试剂的灵敏度、特异性，并进行相关性分析。

2结果

2.1破伤风抗体标准品的重复性检测及定量曲线的建立：

对检测结果进行批内差异分析，批内差异由每批检测样品内同一样品的各个检测值之间的变异系数[标准差/均值CoefficientofVariance，CV（%）]表示。通过对6个标准品（浓度分别为0.00、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16IU/ml）的8次重复检测，计算6个标准品OD值的均值、标准差、和变异系数，可见各标准品浓度的OD值变异系数均在12%-20%之间（表1），有较好的重复性，通过标准品浓度和对应OD值作图可以看出，破伤风抗体浓度在0-0.16IU/ml之间时形成明显的线性关系（图1），计算线性回归方程y=7.7489x-0.0018，r=0.99。

表1：试剂盒标准品重复检测结果分析

图1各标准品浓度与对应OD值关系图

2.2双盲法平行检测结果分析

对备检300份血清进行破伤风抗体检测，得到了IgG抗体的含量，与标准法进行比较计算（表2），该国产试剂敏感性为94.1%，特异性为96.8%，约登指数为0.909，阳性预测值为98.5%，阴性预测值为88.5%。

表2：试剂盒检测结果与标准法检测结果比较分析

通过配对t检验比较抗体浓度，t=0.562，P>0.05，国产试剂检测得到的抗体浓度与标准检测方法得到的抗体浓度没有显著性差异。

2.2相关性分析

用秩和检验的方法比较两个抗体结果的相关性，将2种方法测定结果分别从小到大各组编秩，若有相同测定值，取平均秩次，经检验rs=0.987798﹥rs0.05（300），故P<0.05，标准法测定结果与国产试剂盒测定结果之间有显著的正相关。

3讨论

目前检测破伤风IgG抗体主要用于了解人群抗体水平，以及疫苗免疫成功率的监测，对于及时发现免疫薄弱地区，防治疾病的流行和暴发，有着重要的意义。

间接血凝法在检测破伤风抗体技术早已十分成熟，但是诸多影响因素，使其批间差异较大。待检血浆样品须经过灭活，血球要预温处理，结果要过夜观察，另外因样品稀释孔数较多和用肉眼判断凝集终点，增加了操作误差和结果判断的主观随意性，重复性和稳定性差[1]。

从实用、经济以及人道角度考虑，ELISA技术越来越受到青睐。该技术操作简便，有商用试剂盒，利于标准化，在一定范围内，试验结果与血凝试验相关性好，适于大规模试验。刘彩云[2]等报道间接ELISA法检测破伤风类毒素免疫豚鼠的血清抗体水平与小鼠体内中和毒素试验法（TNT）的结果有很好的相关性。朱华松[3]等根据大规模破伤风类毒素免疫人血浆筛选的需要，研制出间接ELISA法检测试剂，并建立ELISA法检测定量标准和免疫人血浆的筛选方法，于现场与IHA法进行了比较，并通过动物试验验证其准确性和可靠性，取得了满意的结果。张国强[4]在实验中应用双抗原夹心法建立的ELISA定量检测法，能特异准确地反映出人体中的破伤风抗体水平。经实际应用验证，该法在进行大规模献血员破伤风抗体的定量测定中，具有较好的特异性和重复性。

本次实验所有检测均由同一人员操作，每次检测的试验条件都相同，可排除操作人员和试验条件对试验准确度的影响。本实验对国产破伤风IgGELISA检测试剂盒的稳定性和准确度进行了评价，并与标准检测方法进行了比较，采用标准品及300份健康人血清进行了可重复性检测。检测结果提示，该产品的检测结果均满足试剂盒自身的质量控制标准，试剂盒检测标准品的CV均<20%，满足ELISA的常规质量控制标准。

通过对300份血清标本的检测，该产品敏感性、特异性、约登指数、阳性预测值、阴性预测值均较高。与标准法比较，2次检测结果差异无显著性，且有显著的正相关。检测抗体浓度在0.01～0.16IU/ml之间，呈良好的线性关系（r≥0.98），有较高的敏感性和特异性，试验操作规范，简单快捷，不受条件限制利于大量标本的快速检测，满足精确定量的需要，对该病的临床诊断、流行病调查、献血员筛选及破伤风免疫球蛋白制剂的定量[5]等，提供了一种更为简捷精确切实可行的检测手段。

参考文献

[1]GinlianoG，PiniC，CollottiC，etal.Theuseofanimmunoenzymaticassayfortheestimationoftetanusantitoxininhumansera:acomparisonwithseroneutralizationandindirecthaemagglutination[J].JBiolStand1985，13（1）:53-59.

[2]刘彩云，王淑芳，张振龙等.应用ELISA与中和试验测破伤风抗毒素的比较[J].中国生物制品学杂志1995，08（4）:175-178.

[3]朱华松，周志军，尹斌等.人破伤风类毒素免疫血浆筛选试验中两种抗体检测方法的比较[J].微生物学免疫学进展，2006，34（1）:39-42.

[4]张国强，冯素英，王晋等.酶联免疫破伤风抗体定量试剂的研制及应用[J]微生物学免疫学进展2006，34（2）:23-26.

[5]中国生物制品规程[S].中国生物制品标准化委员会编.2000年版.化学工业出版社，345.