Calretinin、AE1/AE3免疫细胞化学双重染色法在胸腔积液细胞学诊断中的应用

Calretinin、AE1/AE3免疫细胞化学双重染色法在胸腔积液细胞学诊断中的应用

王晓红周美霞田慧张敏黄永君张蕤郭丽萍

（内蒙古达拉特旗人民医院病理科内蒙古鄂尔多斯014300）

【摘要】目的：Calretinin、AE1/AE3免疫细胞化学双重染色法鉴别胸腔积液中脱落细胞的性质及组织来源。方法：通过141例胸腔积液中普通HE涂片不能明确良、恶性的疑难病例11例、恶性病例19例的细胞块制作、免疫细胞化学双重染色及单染色，对疾病的性质、组织学类型及来源做出判断。结果：良性病变在免疫细胞化学双重染色中只见到一种细胞着色，核、浆染为棕黄色的Calretinin阳性间皮细胞；上皮来源的恶性肿瘤病变中除间皮细胞胞核着棕黄色外，还可看到胞浆着色为红色的AE1/AE3阳性肿瘤细胞。结论：胸腔积液涂片可疑恶性的病例，可以通过制作细胞块、免疫细胞化学双重染色而确定疾病的性质；恶性病例可通过免疫细胞化学单染色法确定组织学类型及来源。

【关键词】胸腔积液；细胞块；免疫细胞化学双重染色

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）02-0210-02

免疫细胞化学双重染色法是在同一组织切片上显示两种不同抗原成分的免疫细胞化学方法[1]，以鉴别使胸腔积液中增生及退变的间皮细胞和上皮来源的恶性肿瘤细胞。胸腔积液中脱落的恶性肿瘤细胞有些异型明显容易判断，有时则与退变、增生的间皮细胞之间难区别；同时间皮细胞具有双向分化的特性，除表达间皮细胞的标记物Calretinin、D2-40、WT-1等之外可以同时表达AE1/AE3、CK7等上皮细胞标记物，分子水平上与腺上皮来源的恶性肿瘤之间也难以鉴别。双重染色法的应用，从分子水平上区别了两者，在鉴别诊断方面取得了突破性的进展。在双重染色中确定为恶性肿瘤的病例，我们再追加常规免疫细胞化学染色，进一步明确组织来源及细胞学类型。

1.材料与方法：

1.1收集我院2012-1至2012-12患者的胸腔积液141例，35岁～79岁。胸腔积液首先做涂片行HE染色，确定良恶性，可疑恶性及恶性者制备成细胞块以备免疫细胞化学染色及双重染色。

1.2穿刺抽取胸腔积液，200ml以上。

1.3细胞块的制备

胸腔积液静置后取底部沉淀样本50ml，3000转/分离心5-10分钟。吸干上清液，沿管壁加入95%酒精，3000转/分离心5分钟，静置1小时后将沉淀物取出，用包埋纸包好，放入脱水盒，10%中性福尔马林固定1小时，按常规制备蜡块。

1.4切片及抗体

石蜡块切片，厚度4～5μm。所染一次抗体：TTF-1、Cam5.2、CK7、AE1/AE3、Calretinin、CDX-2、ER、PR、GCDFP-15、WT-1以及二次抗体、双染试剂盒。

1.5双重染色法

使用APES处理的载玻片，脱蜡至水。按免疫组织化学染色常规处理切片后加入一次抗体AE1/AE3和Calretinin，4℃过夜孵育。二次抗体和显色剂的投入：PBS常规处理后，将等比例混合的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG聚合物、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG聚合物二次抗体加入，室温孵育1小时。PBS常规处理后加入AP-RED底物，孵育5～20分钟，蒸馏水冲洗以终止反应；再加入DAB底物，孵育1～10分钟，蒸馏水冲洗以终止显色，封片剂封片。

1.6结果判定

双重染色中上皮标记物AE1/AE3所标记的上皮细胞呈红色，Calretinin所标记的间皮细胞核呈棕黄色，胞浆呈红色。其他标记物的免疫细胞化学单染色阳性细胞胞浆或细胞膜呈棕黄色着色。染色时设阳性或阴性对照。

2.结果

141份标本经常规涂片、HE染色后镜检判断确定：良性炎症性病变111例、恶性病变19例，可疑恶性病例11例经免疫细胞化学双重染色法检测确定5例为恶性，其余6例为良性病变。良性病变双染时，核呈棕黄色，胞浆呈红色，判断为正常间皮细胞（图1）。恶性及可疑恶性病例经免疫细胞化学双重染色，源于上皮的恶性肿瘤细胞胞浆着色，呈红色，同时能见到其间散在的核呈棕黄色的正常间皮细胞（图2）。证实为上皮来源恶性肿瘤细胞者再经免疫细胞化学单染色法进一步鉴别，原发肺腺癌者CK7阳性，TTF-1阳性（图3），CAM5.2阳性，正常间皮细胞除Calretinin阳性之外，间皮细胞的另一标记物WT-1亦阳性（图4）。肺转移自肠道的腺癌者CK7阴性，CDX-2阳性；肺原发鳞癌者CK5/6阳性，34βE12阳性；转移自乳腺者ER、PR阳性或GCDFP15阳性。最终结果141例胸腔积液中良性病例117例，恶性病例24例。经免疫细胞化学双染色法及单染色法证实24例恶性病例中肺原发腺癌10例，原发肺鳞癌6例，肠道腺癌肺转移2例，乳腺癌肺转移2例，其余4例类型难以确定。

3.讨论

体腔积液在传统的涂片中不能重复制片，制备成细胞块可以重复切片进行免疫细胞化学染色[2]，并且双重染色法可以在同一切片中用两种不同的抗体分别标记两种不同类型的细胞，从而区别这两种细胞，确定其各自的性质。胸膜腔内衬覆的间皮细胞具有双向分化的特征，细胞形态多样，小圆形、印戒状、梭形、多边形或类圆形，炎症刺激所致的反应性增生、退变的间皮细胞其形态变化更大，单从形态学的角度难以判断其性质，与上皮来源的恶性肿瘤细胞很难鉴别。利用上皮细胞的标记物广谱CKAE1/AE3和间皮细胞的标记物Calretinin[1]做双重染色，使恶性上皮性肿瘤胸腔积液中脱落的反应性间皮细胞和肿瘤性上皮细胞在同一切片上被分别标记以鉴别诊断。其他的标记物如原发肺癌的标记物如TTF-1、CK7、CAM5.2等腺癌的标记物和鳞癌的标记物CK5/6、34βE12、以及肠道肿瘤标记物CDX2、乳癌标记物ER、PR、GCDFP15等来判断肿瘤细胞的来源。

【参考文献】

[1]林幸子，二重染色法.PathologyandClinicalMedicine,病理と临床，临时增刊号，2007，ISSN0287-3745,Vol.25:260-266.

[2]梅平,骆新兰,刘艳辉等.免疫细胞化学在浆膜腔积液中对腺癌细胞及反应性间皮细胞的鉴别价值。中华病理学杂志2005，34（6）：368-369.