缺氧诱导肿瘤细胞BCL-2表达促进LPPCN样细胞核凝集的形成

缺氧诱导肿瘤细胞BCL-2表达促进LPPCN样细胞核凝集的形成

贾利

贾利

（绵阳市第三人民医院肿瘤科四川绵阳621000）

【摘要】目的：探索分析缺氧诱导肿瘤细胞BCL-2表达促进LPPCN样细胞核凝集的形成影响。方法：选择B16黑色素瘤细胞为研究对象，利用CoCL2缺氧模型来模拟缺氧微环境，采用RT-PCR和Western进行BCL-2蛋白和RNA的表达影响，利用免疫荧光技术观察BCL-2表达定位情况。结果：正常氧条件下，BCL-2表达随着时间推移而下降，缺氧条件下，BCL-2表达随着时间延长而呈现逐渐上升的趋势，缺氧12h后，BCL-2定位于细胞质，缺氧36h时，正常氧条件下的BCL-2定位无明显变化，缺氧条件下的BCL-2可见细胞核表达。结论：缺氧条件可促进肿瘤细胞形成LPPCN样细胞核凝集。

【关键词】缺氧；诱导；肿瘤细胞；BCL-2；LPPCN样细胞核凝集

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）03-0030-02

HypoxiainducingtumorcellstheBCL-2expressionsoastofacilitatetheformationofLPPCNsamplenucleusaggregation

Jiali.ThethirdhospitalofMianyang,Sichuan621000,China

【Abstract】ObjectiveToexploreandanalysistheBCL-2hypoxiainducingtumorcellspromotestheformationofLPPCNsamplenucleusaggregationeffect.MethodsChooseB16melanomacellsastheresearchobject,theuseofCoCL2modeltosimulatehypoxiamicroenvironmenthypoxia,usingPCRandWesternfortheBCL-2proteinandRNAexpression,positioningusingimmunofluorescencetechniquetoobservetheBCL-2expression.ResultsUndertheconditionofnormaloxygen,overtime,anddecreasedtheBCL-2expression,anoxiccondition,theBCL-2expressionshowsthetendencyofincreasingwithlonger,12hafterhypoxia,theBCL-2locatedinthecytoplasm,anoxic36h,undertheconditionofnormaloxygentheBCL-2positioninghasnoobviouschange,hypoxiaundertheconditionoftheBCL-2canbefoundinthenucleusexpression.ConclusionHypoxiaconditionscanpromotetumorcellformationLPPCNnucleusaggregation.

【Keywords】Hypoxia;Induction;Thetumorcells;TheBCL-2;LPPCNnucleusaggregation

根据有关资料[1]，缺氧环境会使得某些特定区域的肿瘤细胞出现基因突变，从而会促进肿瘤的生长，LPPCN在形态学上表现为线性排布的固缩肿瘤细胞[2]，有研究人员推测其是VM（血管生成拟态）的空间结构形成基础，研究选择B16黑色素瘤细胞为研究对象，探索分析缺氧诱导肿瘤细胞BCL-2表达促进LPPCN样细胞核凝集的形成影响，现报道如下。

1.资料和方法

1.1一般资料

选择B16黑色素瘤细胞为研究对象方法，来源为C57/BL小鼠，培养条件为RP-MI1640培养基，其成分中含有10%的胎牛血清和1%的青霉素和链霉素，培养温度为37℃，于5%的CO2条件下进行恒温培养。

1.2方法

①常规培养B16细胞；②建立缺氧模型，研究采用CoCL2缺氧模型（最终缺氧浓度为200μmol/L[3]）来模拟肿瘤细胞的缺氧微环境；③进行细胞增殖实验，收集对数期生长的B16细胞，于不同时间点进行观察；④利用伤口愈合实验，SRP实验评价缺氧条件对肿瘤细胞的前移和增殖造成的影响；⑤采用RT-PCR和Western进行BCL-2蛋白和RNA的表达影响；⑥利用免疫荧光技术观察BCL-2表达定位情况。

1.3统计学方法

对上述细胞的各项记录数据进行分类和汇总处理，采取统计学软件SPSS19.0对上述汇总数据进行分析和处理，计数资料采取率（%）表示，计量资料采取平均值±标准差（x-±s）表示，采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1缺氧条件对肿瘤细胞凝集和增殖以及迁移能力的影响情况

①缺氧36h到48h后，绝大多数细胞核有核深染区，超过30%的细胞核呈现高度凝集状态，其表现为小凝集体或者单独的凝集体，未见明显的细胞凋亡现象，正常氧条件下细胞核大小一致，核仁清晰，形态规则；②SRP试验检测到，与正常氧条件相比，缺氧可以明显的抑制肿瘤细胞的增殖，正常氧条件的肿瘤细胞的增殖活性是缺氧条件的1.3倍，差异具有统计学意义（P<0.05）；③伤口愈合试验可见，缺氧48h，正常氧条件下的细胞伤口完全愈合而缺氧条件下的肿瘤细胞中大多数迁移能力被抑制，但是显微镜下可见伤口区存在球形，迁移能力较强的细胞。

2.2缺氧条件对BCL-2表达的影响

采用定量RT-PCR和Western检测到正常氧条件下，BCL-2表达随着时间推移而下降，缺氧条件下，BCL-2表达随着时间延长而呈现逐渐上升的趋势，采用免疫荧光法观察到，缺氧12h后，BCL-2定位于细胞质，缺氧36h时，正常氧条件下的BCL-2定位无明显变化，缺氧条件下的BCL-2可见细胞核表达。

3.讨论

肿瘤是一种细胞增殖和死亡均发生了异常的疾病，在某种特定微环境下，肿瘤细胞可以出现塑形改变，进而形成血管生成拟态。在1999年，国外学者研究发现高度恶性黑色素瘤是一种不依赖内皮细胞的全新肿瘤内血液供模式。目前一般认为，在恶性肿瘤发生和发展过程中，细胞凋亡抑制比细胞过度增殖所起的作用更重要。细胞凋亡是有核细胞在凋亡刺激信号作用下通过启动细胞内死亡机制，经过一系列信号转导途径，最科发生细胞程序性变性和死亡的过程。临床实践和基础研究表明，对肿瘤血管生成的研究有助于开发全新的抗肿瘤治疗方法。肿瘤血管的生成一直是国内外研究热点问题，肿瘤生长和转移需要有营养物质和氧气的供给。在经过临床研究中发现，肿瘤细胞在缺氧条件下侵袭力更强，血管样管道更易形成。一些学者在小鼠和人类的恶性黑色肿瘤中发现一种呈网络状或者线状分布的特殊的细胞死亡形式，即LPPCN，这是一种肿瘤细胞坏死灶，主要由于细胞增生使交界处细胞压力而坏死，一旦血液进入这个管腔，就成导致细胞高度缺氧，在形成LPPCN早期条件下，能够表达BCL-2，并呈现细胞核凝聚现象，截至目前，有关缺氧导致肿瘤细胞的凋亡能力改变的具体机制尚未明确[4]，本次研究采用体外细胞实验的方式模拟肿瘤细胞缺氧环境，分析LPPCN样核凝集出现的条件。

根据研究结果，缺氧条件下，B16肿瘤细胞的组织形态与LPPCN细胞呈现相同的特点，在伤口愈合实验中，缺氧条件下的细胞大部分迁移较慢，在伤口区存活部分适应的肿瘤细胞，出现了形态上的变化，其迁移能力优于正常氧条件下的肿瘤细胞，这一结果证实了缺氧条件下存活的肿瘤细胞与形成VM的细胞特征相似，因此，笔者认为，缺氧诱导核凝集是导致LPPCN形成的基础。

BCL-2是凋亡调节蛋白家族[5]，其功能的紊乱与凋亡抗性的产生密切相关，BCL-2抗凋亡机制主要是：BCL-2抑制有促凋亡作用的细胞色素C从线粒体释放到细胞浆，影响细胞跨膜转运，改变钙离子分布，而且BCL-2作为抗氧化剂，调节细胞氧化还原状态，阻断氧化作用对细胞组成成分的破坏，保护细胞免核酸酶损害，以抑制DNA断裂。在发生凋亡的过程中，BCL-2家庭的促凋亡蛋白在凋亡相关因子激活下，使得线粒体的完整性受到破坏，促进凋亡因子释放，从而使得凋亡的发生。本次研究结果可见，缺氧条件下，BCL-2表达随着时间延长而呈现逐渐上升的趋势，另外，缺氧36h时，缺氧条件下的BCL-2可见细胞核表达，表明BCL-2可能进入细胞核来发挥更大的作用，此外，高水平的BCL-2表达使得肿瘤细胞获得与恶劣微环境对抗的优势。

综上所述，缺氧条件可促进肿瘤细胞形成LPPCN样细胞核凝集。

【参考文献】

[1]杜静，孙保存，刘易欣.缺氧诱导因子-1在肿瘤学中的研究进[J].临床与实验病理学杂志，2013，29(05);548-551.

[2]倪小晴，佐阳，吴继锋.HIF-1α蛋白在胃癌中的表达及其与Wnt信号通路、上皮-间质转化的关系[J].临床与实验病理学杂志，2014，30(02);140-144.

[3]汪攀，赵秀文，兰川等.缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究[J].第三军医大学学报，2015，33(07):616-622.

[4]王文静，梅命珠，齐聪等.缺氧诱导因子-1与肿瘤干细胞的研究进展[J].临床肿瘤学杂志，2015，20(07):666-670.

[5]郭晓川，石燕，陈丽等.缺氧诱导因子对肿瘤细胞上皮-间质转化的诱导机制[J].解放军医学院学报，2015，36(01):90-93.