Th１７细胞在食管鳞状细胞癌组织中的分布及其临床意义

Th１７细胞在食管鳞状细胞癌组织中的分布及其临床意义

彭峰１郑敏惠２

彭峰１郑敏惠２１．湖北医药学院附属太和医院肿瘤科湖北十堰４４２０００;２．湖北医药学院附属太和医院儿童医疗中心湖北十堰４４２０００

【摘要】目的探讨食管鳞状细胞癌患者Th１７细胞水平与临床病理特征之间的关系.方法收集湖北医药学院附属太和医院食管鳞状细胞癌标本,通过流式细胞术和免疫组织化学的方法检测癌组织和癌旁组织中Th１７细胞水平及分布情况,并分析其与临床病理特征的关系.结果食管鳞状细胞癌患者癌组织中Th１７细胞占淋巴细胞比例为(４．６７±３．８６)％,癌旁组织中Th细胞为(３．３７±４．２２)％,癌组织中Th１７细胞水平高于癌旁组织;免疫组化法检测癌组织中的Th１７细胞为８．４２±４．６１个/HPF,癌旁组织中为５．８７±２．７５个/HPF癌组织高于癌旁组织;在分期晚、有淋巴结转移及肿瘤浸润较深的患者中,癌组织和癌旁组织Th１７细胞水平较高.结论Th１７细胞参与了食管癌的发生、发展,高水平提示食管癌预后不良.【中图分类号】R４７３．７【文献标识码】B【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－１２７７－０２

食管癌是本地区比较高发的恶性肿瘤之一,最常见的病理类型为鳞状细胞癌.近年来研究发现食管局部的慢性炎症可以引起基底膜的改变,以及食管上皮细胞的异常增生,并与食管癌的发生也有密切的关系[１,２].Th１７细胞是近些年来才被发现的免疫细胞,以分泌IL－１７为主要特征,其免疫表型为CD４＋/IL－１７＋,在多种慢性炎症性疾病中都有参与,但是在肿瘤特别是食管癌中的作用还不是非常明确[３－５].本研究以食管鳞状细胞癌患者为研究对象,通过对食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中的Th１７细胞进行检测,以了解Th１７细胞的分布,并与其临床特征进行分析,以了解其临床意义,旨在评价Th１７细胞与食管鳞状细胞癌发生、发展的关系.１材料和方法１．１材料１．１．１标本来源选取２０１４年２月至２０１４年１２月在湖北省十堰市太和医院进行手术,并术后病理确诊的食管鳞状细胞癌患者共计５７例,其中男性４７名,女性１０名,中位年龄５７岁,所有患者术前未行化疗、放疗等肿瘤病因性治疗,术后根据UICC恶性肿瘤TNM分期第７版进行分期,其中Ⅰ期１４例,Ⅱ期２３例,Ⅲ期２０例,患者具体情况见表１.

１．１．２主要试剂鼠抗人IL－１７A抗体购于美国eBioscience公司,即用型免疫组化超敏UltrasensitiveS－P(鼠/兔)试剂盒和DAB显色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司,PE－Cy５标记的鼠抗人CD４抗体、PE标记的鼠抗人白细胞介素１７(IL－１７)抗体购自美国eBioscience公司.１．２实验方法１．２．１食管癌组织及癌旁组织中淋巴细胞的分离收集手术切除后的新鲜食管癌组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘１cm以上),剪除出血、坏死组织,将剩余组织剪碎后置于组织样本制备仪中,加入４mlPBS,处理５分钟,从出孔中吸出细胞悬液,离心后弃上清,细胞沉淀重悬、过滤,根据梯度离心法收集１００％淋巴细胞分离液界面上的细胞,即为所需淋巴细胞.

１．２．２流式细胞术检测Th１７细胞将收集到的淋巴细胞重悬后分别加入PMA、离子霉素及BFA,在３７℃、５％二氧化碳条件下刺激孵育５小时,取待测样品分别加入PE－Cy５标记的鼠抗人CD４抗体、１００μL破膜剂以及PE标记的鼠抗人白细胞介素１７(IL－１７)抗体,对照管中加入相应的同型抗体对照,室温下避光孵育３０分钟,加入溶血剂３００μL后室温下避光孵育１５分钟,加入PBS离心后弃上清,细胞沉淀用３００μLPBS重悬,最后上流式细胞仪进行分析检测.Th１７细胞以CD４＋IL－１７＋细胞在CD４＋细胞中的比例来表示.

１．２．３免疫组织化学方法检测食管癌及癌旁组织中Th１７细胞收集到的食管癌及癌旁组织经１０％中性甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,经二甲苯脱蜡和梯度酒精水化处理后,经柠檬酸抗原修复液高温高压抗原修复,滴加过氧化物酶阻断剂以阻断内源性过氧化物酶活性,室温孵育１０分钟后PBS清洗;切片上滴加正常非免疫动物血清,室温孵育１０分钟后再次PBS清洗;滴加鼠抗人IL－１７A抗体,室温下孵育６０分钟;PBS清洗后滴加生物素标记的二抗,室温孵育１０分钟后PBS清洗;每张切片滴加链霉素抗生物素－过氧化物酶溶液,室温孵育１０分钟,PBS清洗;切片上滴加新鲜配制的DAB溶液,在显微镜下观察至组织显色棕色后,自来水冲洗终止显色,并苏木素复染;最后切片经梯度酒精脱水干燥,用中性树胶封固.显微镜下IL－１７A表达以细胞质中棕黄色颗粒为阳性.１．２．４统计学分析所有数据运用SPSS１７．０进行统计学分析,结果均以均数±标准差表示,方差齐性检验后两样本均数间采用两样本t检验,P＜０．０５表示有统计学意义.２结果２．１流式细胞术检测Th１７细胞水平食管癌组织中Th１７细胞占淋巴细胞比例为(４．６７±３．８６)％,癌旁组织中Th细胞为(３．３７±４．２２)％,癌组织中Th１７细胞水平高于癌旁组织,两者存在统计学差异(p＜０．０５).２．２免疫组织化学方法检测组织中Th１７细胞分布以鼠抗人IL－１７A抗体为一抗,通过免疫组织化学方法,标记组织中的Th１７细胞,观察其在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中的分布情况,随机选取１０个高倍镜视野(×４００),对IL－１７A阳性细胞进行计数,并注意观察阳性细胞分布,结果显示癌组织中的Th１７细胞为８．４２±４．６１个/HPF(HighPowerField,高倍镜视野),癌旁组织中为５．８７±２．７５个/HPF,两者存在统计学差异(p＜０．０５),癌组织中Th１７细胞水平高于癌旁组织.镜下可观察到Th１７细胞主要分布于肿瘤间质组织中(图１),在癌实质组织中少见分布,且Th１７细胞多在间质中血管周围聚集(图２).图１Th１７细胞主要分布于肿瘤间质组织中,箭头处为Th１７细胞(×２００)图２Th１７细胞主要聚集于血管周围,箭头处为小血管(×４００)２．３Th１７细胞与临床病理特征的关系:通过将流式细胞术Th１７细胞结果与患者临床病理特征进行统计学分析(见表２),发现癌组织及癌旁组织中Th１７细胞水平与患者的临床病理分期、淋巴结转移、原发肿瘤情况有关,在分期晚、有淋巴结转移及肿瘤浸润较深的患者中,癌组织和癌旁组织Th１７细胞水平较分期早、_______无淋巴结转移及肿瘤浸润较浅的患者高.Th１７细胞水平与年龄、性别、肿瘤分化程度无关(P＞０．０５).３讨论Th１７细胞是一类在研究自身免疫性疾病过程中新确立的辅助性T细胞亚群,其特征是分泌白介素１７(IL－１７),由于其在炎症中的促进作用,参与了多种自身免疫性疾病的发生和发展.但是Th１７细胞在肿瘤中的作用目前还不是非常明确.在对多种不同类型肿瘤患者的研究中,均发现有患者外周血或肿瘤组织中Th１７细胞的高水平表达,如亓磊等[６]研究发现食管癌患者外周血中Th１７水平较正常健康人高;Chen等[７]发现宫颈癌和宫颈上皮内瘤变(CIN,cervicalintra－epithelialneoplasia)患者外周血中Th１７细胞较多.Chen等[８]以下咽癌患者为研究对象,发现肿瘤组织中Th１７细胞相关性细胞因子较癌旁组织中高.同时在一些肿瘤的研究中发现Th１７细胞高水平与患者不良预后有关,Zhang等[９]在肝癌的研究中发现肿瘤组织中Th１７细胞水平的增加,往往预示着总体生存率和无病生存率的下降;Yamada等[１０]、Zhang等[１１]学者在胃癌与Th１７细胞的研究中,发现分期越晚、五年生存率越低的患者,体内Th１７细胞的水平越高.这些都提示Th１７细胞往往与肿瘤预后不良有关.具体的机制研究认为可能与Th１７细胞通过分泌细胞因子促进肿瘤新生血管有关[１２,１３],此外还有研究认为与Th１７细胞分泌的IL－１７、IL－２３等细胞因子抑制体内的免疫监视机制,从而促进了肿瘤的发生、发展[１４].

但也有一些研究提出Th１７细胞可能在体内发挥抑制肿瘤的作用,Koyama等[１５]在小细胞肺癌研究中发现,局限期和初发患者Th１７细胞水平高于进展期和复发患者,并提出Th１７细胞通过抑制Treg细胞功能发挥抗肿瘤作用.Nunez等[１６]的研究也认为Th１７细胞有抗肿瘤作用,Th１７细胞通过诱导、趋化Th１效应性Th１细胞至肿瘤组织中发挥抗肿瘤作用.Muranski等[１７]利用Th１７细胞对B１６黑色素瘤小鼠进行过继性细胞治疗,发现小鼠在并发严重白癜风同时,肿瘤有明显减退.综上所述,Th１７细胞在肿瘤的生物学行为中到底发挥何种作用尚不明确.本研究中通过免疫组织化学和流式细胞术的方法,均发现食管癌组织中的Th１７细胞水平高于癌旁组织,且分期晚的患者中,不论是癌组织还是癌旁组织,Th１７细胞水平均高于分期较早期的患者,这提示Th１７细胞高水平预示着食管癌预后不良.本研究中还发现在肿瘤浸润较深,以及有淋巴结转移的患者中,Th１７细胞水平也较高,说明Th１７细胞在肿瘤细胞浸润、转移的过程中发挥了作用.同时我们还观察到Th１７细胞主要分布于间质中小血管周围,提示Th１７细胞可能与小血管的生成有关,但是具体的机制还需要在今后的研究中进一步探讨.参考文献[１]张国红,苏敏,and田东萍,慢性炎症介导的基底膜改变在食管上皮癌变中的作用．癌症,２００５．２４(９):p．１０７１－１０７５．[２]冯笑山,etal．,洛阳地区２０年间食管病变的变化分析．中国肿瘤临床与康复,２０１０．１７(２):p．９７－９９．[３]彭峰and叶韵斌,Th１７细胞与肿瘤的研究进展．医学综述,２０１１．１７(１０):p．１４８４－１４８６．[４]Kiraz,Y．,Y．Baran,andA．Nalbant,Tcellsintumormicroenvironment．TumourBiol,２０１５．[５]Ye,J．,R．S．Livergood,andG．Peng,TheroleandregulationofhumanTh１７cellsintumorimmunity．AmJPathol,２０１３．１８２(１):p．１０－２０．[６]亓磊,etal．,食管鳞癌患者外周血中Th１７细胞的检测及其临床意义．中国肿瘤生物治疗杂志,２０１１．１８(１):p．５９－６２．[７]Chen,Z．,etal．,TheTh１７/TregbalanceandtheexpressionofrelatedcytokinesinUygurcervicalcancerpatients．DiagnPathol,２０１３．８:p．６１．[８]Chen,X．,etal．,Th１－,Th２－,andTh１７－associatedcytokineexpresＧsioninhypopharyngealcarcinomaandclinicalsignificance．EurArchOtoＧrhinolaryngol,２０１５．[９]Zhang,J．P．,etal．,IncreasedintratumoralIL－１７－producingcellscorＧrelatewithpoorsurvivalinhepatocellularcarcinomapatients．JHepatol,２００９．５０(５):p．９８０－９．[１０]Yamada,Y．,H．Saito,andM．Ikeguchi,PrevalenceandclinicalreleＧvanceofTh１７cellsinpatientswithgastriccancer．JSurgRes,２０１２．１７８(２):p．６８５－９１．[１１]Zhang,B．,etal．,TheprevalenceofTh１７cellsinpatientswithgastriccancer．BiochemBiophysResCommun,２００８．３７４(３):p．５３３－７．[１２]Kato,T．,etal．,ExpressionofIL－１７mRNAinovariancancer．BioＧchemBiophysResCommun,２００１．２８２(３):p．７３５－８．[１３]Du,J．W．,etal．,Interleukin－１７,producedbylymphocytes,promotestumorgrowthandangiogenesisinamousemodelofbreastcancer．MolMedRep,２０１２．６(５):p．１０９９－１０２．[１４]Teng,M．W．,etal．,IL－２３suppressesinnateimmuneresponseindeＧpendentlyofIL－１７Aduringcarcinogenesisandmetastasis．ProcNatlAcadSciUSA,２０１０．１０７(１８):p．８３２８－３３．[１５]Koyama,K．,etal．,ReciprocalCD４＋T－cellbalanceofeffectorCD６２LlowCD４＋andCD６２LhighCD２５＋CD４＋regulatoryTcellsinsmallcelllungcancerreflectsdiseasestage．ClinCancerRes,２００８．１４(２１):p．６７７０－９．[１６]Nunez,S．,etal．,Thelpertype１７cellscontributetoanti－tumourimＧmunityandpromotetherecruitmentofThelpertype１cellstothetumour．Immunology,２０１３．１３９(１):p．６１－７１．[１７]Muranski,P．,etal．,Tumor－specificTh１７－polarizedcellseradicatelargeestablishedmelanoma．Blood,２００８．１１２(２):p．３６２－７３．