31例负载自体胃癌细胞裂解物DC-CIK细胞免疫治疗细节体会

31例负载自体胃癌细胞裂解物DC-CIK细胞免疫治疗细节体会

王盛崔玉忠谢秀艳

王盛崔玉忠谢秀艳（滨州医学院附属医院临淄区人民医院255400）

【中图分类号】R967【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）30-0089-03

【摘要】目的总结我院31例（2012年5月到2013年6月）负载自体胃癌细胞裂解物DC-CIK细胞免疫治疗全过程中细节上的心得体会。方法31例胃癌病人术中保存肿瘤组织，治疗前制备肿瘤抗原，用血细胞分离机采集外周血单个核细胞，体外培养DC-CIK细胞，连续给病人8次回输治疗，同时加强回输时、回输后不良反应的观察及护理。结果31例病人顺利完成抽血、回输过程，回输后1例病人出现轻微寒战，3例病人在回输后1-3h发热。结论DC-CIK临床应用安全可靠。

【关键词】自体DC-CIK细胞体会

DetailsandexperienceofDC-CIKimmunotherapyloadedautologousGastricCarcinomacelllysatesfor31cases

【Abstract】Purpose：TosummarizedetailsandexperienceinthewholeprocessofDC-CIKcellimmunotherapyloadedautologousgastriccarcinomacelllysatesfor31casesinourhospitalfrom2012.5to2013.6.Methods:Thetumortissuesof31gastriccancerpatientsinsurgeryweresaved，andtumorantigenwaspreparedbeforetreatment,peripheralbloodmonocyteswerecollectedwithbloodcellseparator,DC-CIKcellswereculturedinvitroandtheninfusedforconsecutive8timesfortreatment.Meanwhile，theobservationandnursingofsideeffectwascarriedoutduringandaftertreatment.Result：Bloodcollectionandcellsinjectionweresmoothlycompletedin31patients，1patientshowedaslightshiveraftercellsinjection，and3patientshadafever1-3haftertreatment.Conclusion：TheclinicalapplicationofDC-CIKissafeandreliable.

【Keywords】autologousDC-CIKcellexperience

DC细胞和CIK细胞是肿瘤免疫治疗的两个重要部分。DC细胞是体内摄取、加工、呈递抗原的最重要的专职抗原呈递细胞，它呈递抗原的能力强，且是唯一可以活化初始T细胞的抗原呈递细胞，能识别病原、激活获得性免疫系统。CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，是一种肿瘤过继性细胞免疫治疗细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性；是一类非主要组织相容性复合物（MHC）和非T细胞受体（TCR）限制性的免疫活性细胞，其主要效应细胞的表面标志CD3+CD8+和CD3+CD56+。DC细胞和CIK细胞两者联合能确保高效和谐的免疫反应的完成。我院从2012年5月至2013年6月应用负载自体胃癌细胞裂解物DC-CIK细胞免疫治疗31例胃癌患者，取得了良好的疗效。现将治疗全过程中细节上心得体会介绍如下：

1治疗过程

术前，向病人详细介绍治疗过程，并签署治疗同意书。术中留取肿瘤组织，放-80℃冰箱中冻存，病理确诊后，在无菌条件下，将癌旁非肿瘤组织去除干净，浸于PBS溶液中，然后用眼科剪将组织块剪碎，加入5mlRPMI培养基研磨，经200目、100目网筛过滤后收取细胞悬液，然后用RPMI重悬细胞（1×107/ml），装入5ml无菌冻存管，反复冻融5个循环后，收集细胞裂解物并通过0.2μm滤器过滤，-80℃保存备用。肿瘤细胞裂解物采用BCA法测定蛋白浓度[1]。

无菌条件下，使用血细胞分离机采集患者自体外周血单个核细胞（PBMC），在本院GMP实验室中用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，上清层收集制备自体血清，收集中间白膜层PBMC，用PBS溶液洗涤3次后重悬于GT-T551无血清培养基（加2%自体血清）中，置于37℃，5%CO2培养箱孵育2h，贴壁细胞用于培养DC细胞，加入rhGM-CSF100ng/ml和rhIL-430ng/ml（GM-CSF可促进髓系细胞发育，是生成和维持DC细胞发育和分化的最根本的细胞因子，IL-4抑制粒细胞和巨噬细胞产生，促进单核细胞向DC细胞的转化，并维持DC细胞成熟），刺激细胞向DC细胞分化，第3d进行半量换液；第5d加入肿瘤抗原裂解物50μg/ml，刺激抗原特异性的DC细胞产生；第6d，加入TNF-α细胞因子，刺激DC细胞成熟；第7d，收获DC细胞，手持式细胞计数器计数，其数量应达到1×106个以上，半量DC细胞回输病人，半量与CIK细胞共培养，台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上，流式细胞仪检测DC细胞免疫表型CD11c、HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86等的表达，成熟的DC细胞高表达这些表面标记[2]。

非贴壁细胞用于培养CIK细胞，加入已包被抗CD3单抗（100ng/ml）的细胞培养瓶中,加入1000U/ml的IFN-γ培养，24h后500U/ml的rhIL-2和100U/ml的IL-la，刺激CIK细胞的生长和增殖，定时镜检，根据情况定时换液，补加300U/ml的rhIL-2和500U/ml的IFN-γ，收集培养第7d半量DC细胞与CIK细胞共培养，培养12-16d，手持式细胞计数器计数，数量达到1×1010个以上回输病人。台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上，同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型HLA-ABC、HLADR、CD3、CD4、CD8、CD11c、CD40、CD45、CD56、CD83、CD80和CD86等的表达[3]。在患者使用前，取培养液用丫啶橙染色或革兰染色，追加一次污染检测。此外，对每一批细胞终制剂均要留样检测。

2治疗细节心得体会

2.1血细胞分离机采集患者自体外周血单个核细胞体会

2.1.1我们使用美国血液技术公司提供的MCS+血细胞分离机及其配套的一次性管路耗材采集患者自体外周血单个核细胞，由于外周血单个核细胞采集时间较长，患者难免会产生急躁心理，采集前应对采集过程中需配合的要点和注意事项，进行充分的沟通和提醒。由于MCS+设备采用单针穿刺方式，采血、回输均经同一血管和针头，因此首选肘部粗大、弹性好、易于固定且较为平坦的静脉穿刺，如肘部静脉穿刺困难，可改用股静脉穿刺或由医生帮助行颈内静脉插管，穿刺成功后应重点加强针头的保护[4]。单采时由于抗凝剂中含有枸橼酸盐可与血液中的钙离子结合，引起低血钙，为防止低血钙反应，于采集开始时口服葡萄糖酸钠10mg/10ml2支，可达到良好的预防效果。

2.1.3采集过程中一旦出现心慌、头晕症状时应及时采取平卧位，双腿屈曲，瞩其深呼吸并尽量放松，同时减慢采集速度，一般会很快恢复，如出现面色苍白、冷汗、恶心、呕吐等症状时应立即终止采集，按回输键，取头低足高位，必要时按压门中、内关等穴位，症状缓解后适量补充水分。

2.2肿瘤组织取材及肿瘤抗原制备体会

2.2.1协调好胃肠外科、手术室、病理科、生物治疗科关系，肿瘤组织标本获取前24h胃肠外科通知生物治疗科，生物治疗科人员与患者签署肿瘤组织冻存知情同意书，生物治疗科向手术室与病理室递交收集标本的申请。组织取出前20min手术室护士通知病理科、生物治疗科。

2.2.2肿瘤组织取出后立即放入贴有标签的无菌管中，置于冰上，送往病理科，从手术取出组织到快速冷冻所需的时间越短越好，平均在30min左右，不超过60min。这是保证高质量标本的关键。肿瘤组织应当优先确保病理诊断需求，标本直径≤1cm时不宜切取组织冻存，只能用4％甲醛溶液固定后进行组织切片诊断。对于直径＞1cm的肿瘤，则分别切取肿瘤和尽量远离肿瘤的正常区域。

2.2.3标本存放的温度要求：有效安全地长期保存组织是肿瘤组织必须具备的条件。标本存放的温度最起码应该为-80℃或更低。

2.2.4避免组织污染：每次取材都应使用干净、消毒的器械，取正常和肿瘤组织之间要重新清洁器械或更换新的器械，先取正常组织，再取肿瘤组织。

2.2.5眼科剪将组织块剪切的尽量碎，后用5ml注射器的芯轻轻加压使组织通过200目网孔进入培养皿中，用培养液吹打筛网将细胞冲下，同样的方法用100目网筛过滤。

2.3DC-CIK细胞培养过程体会

2.3.1血细胞分离机分离单个核细胞时保存30-40ml自体血浆，然后56℃水浴锅中30min灭火，再1800rpm离心20min，吸取上层血清，保存备用。无血清培养液中加入2%左右的自体血清培养效果更好

2.3.2淋巴细胞分离液和分离样本从冰箱取出后尽量在20℃水浴锅中复温20min，因为20℃±2℃时分离效果最好。

2.3.3抗CD3单抗最好包被细胞培养瓶，用固相的，最好不用加入游离的抗CD3单抗。这是因为：一是抗CD3单抗包被培养可以在短时间内获得更大数量的DC-CIK细胞；二是游离抗CD3单抗在培养T细胞时是发挥了免疫抑制剂的作用，而固相CD3则发挥了免疫刺激剂的作用。

2.3.4初期培养时，单个核细胞要保证一定浓度，3×106左右为宜，利用细胞之间相互作用促进细胞增殖[5]。

2.3.5CIK细胞培养到5d左右，倒置显微镜仔细观察，如果细胞长势不好，可把所有细胞转到另一新包被的培养瓶，增加抗CD3单抗的量，转之前用吸管轻微吹打细胞。

2.3.6DC半量回输后剩余培养瓶用于CIK细胞扩增用，培养瓶留有部分贴壁DC细胞，成熟的DC细胞分泌的多种细胞因子可提高CIK细胞的增殖活性和细胞毒作用[6]。

2.3.7DC和CIK细胞共培养后，细胞量一定足，至少1×1010以上。

2.4细胞回输及护理体会

2.4.1DC-CIK细胞在回输前常规加入白蛋白有效防止细胞凝聚成团，但是无法绝对保证所有DC-CIK细胞均处于游离的单细胞状态，回输时采用输血器，因为输血器存在内置滤网，可充分过滤成团细胞，可有效减少回输细胞阻塞情况的发生，使用8-9号头皮针，不能使用太细的针头(DC-CIK细胞太大无法通过细针头)。

2.4.2DC-CIK细胞回输时严格控制滴速，先慢后快，开始10min内保持滴速30滴／min，观察患者无反应再根据患者的体质情况以40-60滴／min输入，对有些心肺功能不全者，滴注速度应尽量缓慢，回输过程尽量不超过60min。回输后，由于重力的作用，细胞会渐渐沉降于回输袋，回输过程中每十分钟轻轻倒转回输袋，使细胞均匀地悬浮于生理盐水中。需要注意的是，为减少回输细胞浪费，护理人员需要每五分钟轻弹输血器内置过滤网，细胞悬液回输完毕后，用注射器抽取生理盐水反复冲洗细胞袋中残余细胞数次直至细胞回输袋清亮，最大程度的把DC-CIK细胞回输给病人。

2.4.2发热的护理：DC-CIK细胞治疗常见的副反应是轻度发热，多在免疫细胞输注后4-6h，体温在37.5-38.5℃之间，发热2-6h后自动消退，少数可出现寒战，高热反应，治疗中严格执行无菌操作，每一项操作都要严格遵守无菌原则，才能确保治疗顺利完成。在31例治疗病人中，有1例病人出现轻微寒战，3例病人在回输后2-6h发热，发热体温在37.5-39℃之间。一般处理原则是：体温在38.5℃以下，患者无明显不适反应，不用进行任何处理；体温在38.5-39℃给予一般冰袋物理降温，头部及大动脉处冰袋冰敷或用乙醇擦浴或温水擦浴，测量体温的同时观察患者的面色、脉搏、呼吸、出汗等体征；体温高于39℃，使用消炎痛纳肛处理，杜绝使用地塞米松、泼尼松(强的松)等激素类药物降温。如出现寒战现象，肌注异丙嗪(非那根)25mg治疗，并适当给予吸氧。

3DC-CIK细胞治疗的安全性

DC-CIK细胞治疗所用肿瘤组织、外周血单个核细胞均是自体的，避免了因使用异体血带来的交叉感染。治疗从采血、制备到回输所用耗材均为一次性的，且均在有效期内使用，并且应用血细胞分离机的封闭式管道采集外周血单个核细胞，不丢失血液中其他成分。培养扩增采用无血清培养基，功能可靠，成分明确，来源稳定，避免使用血清可能带来的未知感染，有利于保障选择细胞治疗病人和医务人员的安全。DC-CIK细胞回输前均进行细菌、真菌和支原体、内毒素检测，由本院检验中心和本实验室同时进行检测，结果均为阴性才回输病人。基于以上方面的保证，在31例治疗病人中，有1例病人出现轻微寒战，3例病人在回输后2-6h发热，发热体温在37.5-39℃之间，除一例病人采用解热镇痛药外，2例病人发热均自行消退[7]。病人发热原因可能是DC-CIK细胞中含有IL-2和人血白蛋白,或自己要求回输速度过快。回输前后不同时间对肝功能和肾功能及血常规进行测定，结果未发现DC-CIK细胞对肝功和肾功有损害作用，充分说明了DC-CIK细胞治疗几乎没有副作用，临床应用安全可靠。

参考文献

[1]SabadoRL,BhardwajN.Directingdendriticcellimmunotherapytowardssuccessfulcancertreatment[J].Immunotherapy,2010,2(1):37-56.

[2]IlettEJ,PrestwichRJ,MelcherAA.Theevolvingroleofdendriticcellsincancertherapy[J].ExpertOpinBiolTher,2010,10(3):369-379.

[3]张志伟,宋鑫.DC-CIK细胞临床制备规范化研究[J].中国肿瘤2011年第20卷第2期:85-88.

[4]杨秀梅，袁虹.81例外周血造血干细胞采集的护理与体会[J].实用临床医药杂志,2011年第15卷第18期:79-80.

[5]王志华.CIK细胞治疗癌症：国际临床试验的现状及展望[J].中国肿瘤生物治疗杂志,Apr.2012，Vol.20，No.2:129-137.

[6]DarioSangioloCytokineInducedKillerCellsasPromisingImmunotherapyforSolidTumors[J]JournalofCancer2011,2:363-368.

[7]LiangrongShi?QiZhou?JunWu.Efficacyofadjuvantimmunotherapywithcytokine-inducedkillercellsinpatientswithlocallyadvancedgastriccancer[J]CancerImmunolImmunother(2012)61:2251-2259.