曲古抑菌素A联合紫杉醇对宫颈癌Caski细胞的作用研究

曲古抑菌素A联合紫杉醇对宫颈癌Caski细胞的作用研究

孙晓红

孙晓红（南华大学附属南华医院妇产科421002）

【摘要】目的：研究曲古抑菌素A（TSA）、紫杉醇（TAX）单独和合用对人宫颈鳞癌Caski细胞系细胞生长和侵袭的作用及对E-钙粘蛋白（E-cad）表达的影响。方法：体外培养人宫颈鳞癌Caski细胞系细胞，选择适宜浓度的TSA和TAX作用于Caski细胞，Transwell小室体外侵袭实验检测24小时后对Caski细胞侵袭能力的影响，RT-PCR法检测24小时后E-cad基因的表达。结果：（1）Transwell体外侵袭实验结果显示：TSA和TAX均可抑制Caski细胞的侵袭能力，两药合用能增强对Caski细胞的侵袭抑制作用。(2)RT-PCR法结果显示：TSA和TAX联合能增强TAX对E-cad基因的表达。结论：TSA能抑制人宫颈鳞癌Caski细胞的生长，TSA和TAX联用能增强TAX对Caski细胞的侵袭抑制作用，TSA和TAX对Caski细胞的抑制作用与E-cad基因表达上调有关，其作用机制可能与诱导上皮间质转移相关。

【关键词】曲古抑菌素A紫杉醇宫颈癌作用机制E-cadherin

【中图分类号】R73-36【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）26-0095-04

子宫颈癌是除乳腺癌外妇女发病率最高的恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中占15%[1]。在发展中国家，其死亡率为妇科肿瘤之首。中国约有100，000宫颈癌患者，其中70%是农村妇女[2]，严重威胁着广大妇女的生命和健康。因此，除对宫颈癌病因、发病机制的研究以及寻求更敏感的宫颈癌早期诊断和及时有效的手术治疗外，寻找更有效的药物途径抑制其发展是非常必要的。恶性肿瘤的发生机制往往伴随有表观遗传性的改变，而组蛋白的乙酰化是后者核染色质修饰的重要内容，调控着基因的转录。以HDAC（组蛋白去乙酰化酶）为靶点的HDACI（组蛋白去乙酰化酶抑制剂）为近年肿瘤治疗的热点。曲古抑菌素A是HDACI的代表药物之一，关于TSA与宫颈癌国内外均有不同程度的研究。在多种上皮癌的发生中研究发现均有E-cadherin基因表达水平的下调或突变，如肺癌、乳腺癌、胃癌以及前列腺癌等。本课题选择曲古抑菌素A联合紫杉醇作用于宫颈癌Caski细胞，观察两药对子宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响，分析二者在宫颈癌中是否有相加或协同作用，并检测E-cadherin的表达，初步探讨其可能的作用机制，从而为子宫颈癌的治疗找到一种新的用药方案，同时为其临床治疗提供理论依据及实验室基础。

（一）材料与方法

1实验材料

1.1细胞系：Caski细胞系取自南华大学肿瘤研究所-80℃冰箱冻存细胞。

1.2药品及主要试剂：RPMI-1640培养基（美国Gibco公司），氨苄青霉素、链霉素（华美生物工程有限公司），胰酶（美国Amresco公司），二甲基亚砜（美国Gibco公司），MTT（四甲基偶氮唑蓝）（美国Gibco公司），DMSO（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），曲古抑菌素A9美国Sigma公司),紫杉醇(康为世纪生物工程公司)，Trizol（康为世纪生物工程公司），逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（美国Formentas公司），琼脂糖（艾杰生物工程公司），E-cad抗体（上海生物工程公司合成），TaqDNA酶（美国Promega公司），DNAMarker，溴化乙锭(EB)，DEPC，Matrigel胶（均购于世纪生物工程公司）。

1.3主要仪器设备：无菌操作台，二氧化碳培养箱，倒置显微镜，酶标仪，普通离心机，水浴箱，24、96孔培养板，电子天平，10、100、1000μl加样器，低温高速离心机，凝胶图像分析仪，PCR扩增仪，紫外分光光度计，电泳仪，电泳槽，Transwell小室等。

2实验方法

2.1Tanswell小室测定曲古抑菌素A与紫杉醇合用对Caski细胞侵袭的影响

2.1.1细胞培养：Caski细胞为贴壁细胞，使用RPMI-1640完全培养基，置37oC，5%CO2培养箱中培养，24h换液一次，48-72h传代一次，取生长至铺满培养瓶80%-90%对数生长期细胞用于实验。

2.1.2实验分组：对照组、处理组(TAX组、TSA组、TSA+TAX组)。

2.1.3制备趋化因子a.在5%CO2、37oC、饱和湿度条件下，将Caski细胞用含20%小牛血清RPMI-1640培养基培养在培养瓶中。b.当细胞生长达70-80%饱和度时，在无菌操作台内，用PBS洗瓶2次，加入无血清RPMI-1640液培养。c.24h后无菌台内倾出培养液离心（1000rpm×5min），收集上清液，-20oC保存备用。亦可用含20%小牛血清的培养液代替做为趋化液，本实验所选用的为后者。

2.1.4Transwell小室检测：

①将Transwell置于24孔板内，在Transwell侵袭小室底部聚碳酯膜上，将RPMI-1640培养基和Matrigel按8：1稀释后均匀地铺满，将小室置37oC，5%CO2暖箱内30min，成胶后再置无菌台紫外灯照射过夜。

②实验前置培养箱内，再次成胶30min，在无菌操作台内取生长良好的细胞，对照组加未加药的培养液，处理组加适当药物浓度培养液，调整浓度为1.0×105/ml的细胞悬液200μl接种到成胶的Transwell小室内。

③同时在24孔板内（小室下层）加500μlCaski细胞培养上清液或含20%小牛血清的RPMI-1640培养基作为趋化因子，培养24h。

④从培养箱中取出小室，用棉签头擦掉小室底部的Matrigel胶，PBS洗涤滤膜2次，10%多聚甲醛固定10min。此操作及以下操作可不在无菌台内进行。

⑤结晶紫染色30min-1h。

⑥光镜观察分别取十五个视野计数，进行统计学计算。

2.2RT-PCR法测定E-cadherin基因的表达

2.2.1总RNA的提取：将经胰酶消化传代的Caski细胞，按1x105个/m1接种在培养瓶中，放入37oC，5%CO2培养箱中培养，24h换液，以后48h换液一次，至瓶底铺满80%以上的细胞时，无菌操作台内PBS洗涤培养瓶2次，各组加入RPMI-1640无血清培养液（含青链霉素），以及相应浓度的不同药物，使各组培养瓶中的溶液体积等量，继续培养24h，在氯仿消毒过的洁净桌面提取细胞总RNA。实验分组同侵袭实验:1.对照组；2.药物处理组：(1)TAX组；(2)TSA组；(3)TSA+TAX组。

①倒除培养皿中培养液，PBS洗涤两次，冰上操作；

②培养皿中各加入lm1TriZol试剂，反复吹打；

③将细胞裂解液装入1.5m1EP管（无酶）中，置于冰上5分钟(如为已加TriZol置-70oC保存的，取出样本，室温解冻至全部溶解)；

④每管加入氯仿200μl，轻轻摇晃15秒左右。在室温下静置2-3分钟；

⑤4oC，12000rpm离心15分钟。离心后的混合物分三层，为红色酚一氯仿层、中间层和无色的上清层。将上清层吸出移至新的无酶EP管中；

⑥加入洁净的异丙醇0.5ml（最好新开的），于室温静放10分钟；

⑦4oC，12000rpm离心10分钟；

⑧弃上清，保留沉淀，加入1.0ml75%乙醇(用DEPC水新配制)，7500rpm，5min，4oC离心；

⑨弃上清，点离，尽量吸干液体，避免吸走沉淀，室温干燥沉淀5-10分钟，加入20-30μl无酶水，用移液枪打匀，置55-60oC水浴箱中约10分钟溶解总RNA；

⑩电泳检测。

2.2.2cDNA的合成

取总RNA3μl进行逆转录合成cDNA，按下列逆转录试剂盒操作手册进行操作：

充分混匀后，按42oC，60min；25oC，5min；70oC，5min顺序加热，样品-20oC保存。

2.2.3PCR扩增

所选内参为β-actin，它是在大多数细胞内均有恒定表达的β肌动蛋白，可作为RNA是否降解的评判指标。

E-cad自genbank中查询基因序列，Primer5.0设计合成引物，Blast检测引物的特异性，由上海生物工程公司检测后合成。

反应条件：94oC预变性2min，然后94oC45s，59oC45s，72oC45s，35个循环，最后72oC延伸5min。

3统计学处理

数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，实验数据用均数士标准差(x-±s)表示。实验结果组间比较采用One-WayANOVA分析，显著性意义检测标准为p﹤0.05表示有统计学意义。

(二)实验结果

各药物处理组A、B、C组较对照组透膜细胞数减少，有统计学意义（P＜0.05﹚，C组比A组、B组透膜细胞数明显减少，有统计学意义（P＜0.05﹚，A组、B组、C组间比较有统计学意义（P＜0.05﹚。

图1各药物处理组对Caski细胞侵袭的影响（结晶紫染色，×20倍）

表1Transwell小室检测各组24h的透膜细胞数

注：A、B、C组与对照组比较有显著差异（P＜0.05﹚，A、B、C组间比较有显著差异（P＜0.05﹚。

图2Transwell检测各组24h后Caski细胞的透膜细胞数

将TAX、TSA及联合的侵袭抑制率按金正均法计算所得两药联用q值大于1.15，结果表明两药对Caski细胞侵袭有协同抑制作用，与增殖抑制实验结果一致。

1曲古抑菌素A和紫杉醇联合作用对人宫颈癌Caski细胞E-cad基因表达的影响

1.1总RNA提取产物的鉴定、

总RNA提取产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中检测可见两条清晰的条带，提示RNA产物无明显降解，见图3。

1，2，3，4分别代表对照组、TAX组、TSA组、TAX+TSA组。

1.2曲古抑菌素A和紫杉醇联合作用对人宫颈癌Caski细胞E-cad基因表达的影响

各组RNA提取物经RT-PCR扩增，在凝胶成像系统中可见人宫颈癌Caski细胞E-cadherin基因的表达在空白对照组、A组、B组、C组各组中呈递增趋势。统计数据结果显示各药物处理组A、B、C组与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)，A、B、C组间比较亦有显著性差异(P＜0.01)，如图9、10所示，灰度比均值详见表5。

图4各组24h时E-cadherin的表达强度

M、1、2、3、4分别为DNAmarker、对照组、A组、B组、C组，DNAmarker条带由下至上分别为100bp、300bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

表2各药物处理组24h时E-cadherin表达灰度比均值

注：A、B、C组与对照组比较有统计学意义（P<0.01），A、B、C间比较有统计学意义（P<0.01）。

图5各组24h时E-cadherin表达灰度比均值

（三）讨论

子宫颈癌被称为女性的一大杀手，也是妇科疾病当中难以攻克的一种顽疾。据调查研究预测，截至2020年，全球将有700，000宫颈癌患者，比2002年提高了约40%[1]。近年来子宫颈癌在我国的发病率也明显上升，发病年龄亦逐渐趋向年轻化。宫颈癌的手术治疗早期患者较适用，而对晚期及复发的患者，临床治疗者常感棘手，且疗效不佳，故寻找有效的药物防治宫颈癌迫在眉睫。

曲古抑菌素A是氧肟酸类HDAC抑制剂中极具代表性的药物之一，它对HDAC活性有明显抑制作用，小剂量、低浓度即可导致肿瘤分化，并在不毒害正常细胞情况下选择性地抑制肿瘤生长，特别适合临床应用。TSA被证实有抑制肿瘤细胞的增殖、诱导分化和促进凋亡的作用，对肝癌、乳腺癌以及前列腺癌等多种肿瘤细胞毒作用明显[2,3]实验亦表明，TSA具有选择性抑制肿瘤移植物的生长而不杀伤正常细胞的独特效应[4]。

本研究将较小剂量的TSA与TAX联合后作用于宫颈鳞癌Caski细胞株，用Transwell小室检测24h后对细胞侵袭的影响，结果显示TSA和TAX联合用药后比TAX单独用药的透膜细胞数目明显减少，侵袭抑制率明显升高，金正均法计算q值>1.15，表明两药对Caski细胞的侵袭有协同抑制作用。Drzewiecka等亦研究发现TSA可通过减少磷脂酶γ-1的转录和蛋白生成阻碍磷脂酶γ-1的激活，抑制乳腺癌细胞MCF-7的运动和转移[5]。表明TSA是能够抑制肿瘤细胞侵袭和转移的。本研究RT-PCR显示TSA与TAX两药联合后E-cadherin的表达比TAX单独用药明显增强。Dursun等经临床观察认为E-cadherin的表达水平与宫颈鳞癌的预后呈正相关，表达越低，预后越差，表达越高，预后相对越好，E-cadherin可作为宫颈鳞癌早期侵袭行为和抗侵袭辅助治疗效果的指标[6]。E-cadherin的表达改变可反映出宫颈癌细胞的侵袭能力，在本实验中，两药联合后E-cadherin的增强，同样可说明TSA和TAX联合可增强对Caski细胞的侵袭抑制作用。但两药的联合可增强对Caski细胞侵袭的抑制作用，此种效应是否与药物浓度呈正相关，还有待进一步验证。

在恶性肿瘤的发展及进程中，E-cadherin的下降或缺失占据着重要地位，它与肿瘤的低分化、侵袭力、预后不良因素密切相关，甚至在非肿瘤细胞中亦能作为疾病转归的评判指标，而TSA能影响E-cadherin的表达水平。Ou等表明TSA能诱导癌细胞株组蛋白乙酰化、去甲基化并表达甲基化的E-cadherin和RARβ2基因[7]。Kaimori等表明应用TSA能废除肝细胞中TGF-β1（肿瘤坏死因子）诱导的EMT（上皮细胞-间质细胞转变），提高上皮E-cadherin的表达，逆转肝细胞的纤维化[8]。Wu等发现在E-cadherin表达阴性且具侵袭力的子宫内膜异位细胞中，TSA降低了细胞的侵袭力并激活E-cadherin的表达[9]。已有研究表明TSA作用于肿瘤或非肿瘤细胞后均能提高上皮E-cadherin的表达，使疾病朝着良性方向发展。本实验中，TSA和TAX联用后较TAX单独应用可明显上调E-cadherin的表达，可见E-cadherin的表达上调与TSA和TAX对宫颈鳞癌Caski细胞表现出的协同抑制作用密切相关，E-cadherin也很可能是TSA和TAX两药发挥协同效应的一个作用靶点，但两药具体通过何种方式来调节E-cadherin的表达尚不明确。研究表明，E-cadherin的减少或丢失是EMT一个最重要的标志性变化。EMT的概念早前就已被提出，指在各种因素的作用下，上皮细胞在细胞极性以及细胞间的紧密、黏附连接丢失的情况下，形态和特性向间质细胞转变，并由此获得浸润性和游走迁移能力，这个过程称为EMT[10]。它是上皮细胞恶性肿瘤发生发展的重要机制，目前在多个研究中均有报道，受到极大的关注[11]。由于EMT此种方式能使上皮细胞有效的获得迁移能力，被认为是成体中超过90%的上皮细胞恶性肿瘤发生浸润转移的重要途径之一。Lee等研究表明上皮间质转移(EMT)与宫颈癌的发展进程有关，是宫颈癌发生转移的一种重要的分子机制，通过上调Snail及下调E-cadherin的表达可诱导宫颈癌EMT的发生[12、13]。虽然具体机制仍有待更深入的研究，但TSA和TAX联合方案展现出的高效性，无疑为宫颈癌的治疗又提供了新的用药思路。

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