心肌疾病相关蛋白检验

心肌疾病相关蛋白检验

邱鸿

黑龙江省哈尔滨市平房区人民医院（150060）邱鸿

摘要：

血清肌红蛋白(Mb)存在于心肌与其他肌肉组织中，其分子量为17500，血清肌红蛋白是急性心肌梗死(AMI)患者升高的最早、标志物之一。血清肌红蛋白测定方法有很多，由于分光光度法、电泳法及层析法不能测定低于微克水平的Mb，现已不使用。免疫化学法较灵敏，但抗血清必须是对Mb特异的。

关键词：心肌疾病蛋白检查

一、血清肌红蛋白检验

血清肌红蛋白(Mb)存在于心肌与其他肌肉组织中，其分子量为17500，血清肌红蛋白是急性心肌梗死(AMI)患者升高的最早、标志物之一。血清肌红蛋白测定方法有很多，由于分光光度法、电泳法及层析法不能测定低于微克水平的Mb，现已不使用。免疫化学法较灵敏，但抗血清必须是对Mb特异的。放射免疫试验灵敏度高，对流免疫电泳是一种定性方法，且灵敏度较低，不适宜检测心肌梗死。乳胶凝集试验是个半定量试验，是用肉眼判断终点，具有一定的主观性，而且一些含有高浓度类风湿因子的血清会产生干扰。放射免疫试验灵敏度高，特异性强，但使用放射性核素，现已少用。胶乳增强透射比浊法灵敏度高，特异性好，测定速度快，适用于各型生化自动分析仪，现已在临床上普遍采用。

(一)原理

Mb致敏胶乳颗粒是大小均一的聚苯丙烯乳胶颗粒悬液，颗粒表面包被有兔抗人Mb抗体。样本中的Mb与胶乳颗粒表面的抗体结合后，使相邻的胶乳颗粒彼此交联，发生凝集反应产生浊度。该浊度与样本中的Mb浓度呈正比，在570nm处测定吸光度，可计算样本中Mb的浓度。

(二)试剂

1．试剂I甘氨酸缓冲液(pH9．0)，NaN31．0g／L。

2．试剂致敏胶乳悬液，兔抗人MbIgG致敏胶乳颗粒，NaN3、1．0g／L。

3．Mb校准品。

(三)操作

1．测定条件

温度：37℃。

波长：570nm。

比色杯光径：1．0cm。

反应时间：5分钟。

(四)计算

△A=A2-A1采用非线性多点定标模式，以不同浓度标准品的△A，绘制校正曲线，测定管△A从校正曲线上查出测定结果。

(五)参考值

1．健康成年人肌红蛋白<70μg／L。

2．建议各实验室根据自己的条件，建立本地的参考值。

(六)附注

1．本法适用于各种类型的半自动、全自动生化分析仪，严格按照仪器说明书设定参数进行操作。

2．本法试剂应避光，于2～8℃可保存12个月，-20可保存更长时间，但不宜反复冻融。

(七)临床意义

1．血清肌红蛋白是早期诊断AMI的敏感指标，在AMI发作后1～2小时，在患者血清中的浓度即迅速增加。6～9小时几乎所有的AMI患者Mb都升高。Mb在血液中清除的速度很快，在发病24小时内可恢复到正常，所以连续检测血清中的Mb，对评价患者在治疗期间是否有心肌梗死再次发生具有很重要的意义。患者在发作后第l天内血清肌红蛋白即可返回到基线浓度，当有再梗死时，则又迅速上升，形成“多峰”现象，可以反映局部缺血心肌周期性自发的冠脉再梗死和再灌注。

2．心脏外科手术患者血清肌红蛋白升高，可以作为判断心肌损伤程度及愈合情况的一个重要客观指标。

3．在临床肌病研究中发现假性肥大型肌营养不良患者血清肌红蛋白也升高。

二、血清肌钙蛋白检验

肌钙蛋白是肌肉收缩的调节蛋白，由3个结构不同的亚基组成，即肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)和肌钙蛋白C(TnC)，它附在收缩的横纹肌细微组织上，TnI是一种结构蛋白，它与肌动蛋白及原肌球蛋白互相作用。TnI与肌动球蛋白在静止状态时相结合，抑制肌动球蛋白的ATP酶(ATPase)活性。TnC有4个能结合钙离子的结合点，当它与细胞内的钙离子结合时，能导致整个肌钙蛋白构造上的变化。肌钙蛋白放松了肌动球蛋白，让肌动球蛋白与肌浆球蛋白互起作用，而造成肌肉收缩。肌钙蛋白具有的3种同分异构体，其中两种同分异构体是骨骼肌所特有的，一种同分异构体是心肌所特有的，这三种肌钙蛋白的同分异构体存在着结构上的差异。心肌中的T和I亚基结构不同于其他肌肉组织，心肌钙蛋白T、I(CTNI、CTNI)由于分子量小，分别为37000和24000，所以发病后血中浓度迅速升高。

应用免疫层析与酶免技术可进行快速检测与定量测定，具有快速、灵敏、特异的特点。但对于单个标本检查有不便之处。胶乳增强透射比浊法，目前已有试剂盒供应，可在各型自动生化分析仪上使用，通用性强，已在临床上使用，不同型号的生化分析仪应严格按照说明书设定参数和进行操作。

(一)心肌钙蛋白T、I的快速检测

1．原理应用免疫层析方法测定样品中的特异抗原(CTnl,CTnI)。测试时滴加血清样品于样品槽，样品通过毛细管效应沿试纸膜运动，如果样品中含有特异抗原，试验部位就出现色带，在对照区域内应该有另一颜色条带作为实验对照。

2．试剂

(1)CTnT免疫层析试纸条。

(2)CTnI免疫层析试纸条。

3．操作

(1)将包装纸打开，标记上样品编号。

(2)加5～6滴血清样品到样品槽中。

(3)在10～15分钟内观察色带出现情况。

4．结果判断

(1)阳性：在试验区和对照区均有色带出现。

(2)阴性：仅在对照区有色带出现。

(3)无效：试验区和对照区都没有色带出现。

5．附注

(1)试纸条只能用1次，重复使用无效。

(2)试纸条试验区和对照区均不出现色带，取另一试纸条重复检测仍无结果，则表示试纸条失效。

(3)免疫层析技术测定CTnT、CTnI适合床边快速试验，但只是定性或半定量，要真正了解病情严重程度及治疗措施的选择还需定量测定。

(二)心肌钙蛋白T的ELISA法测定

1．原理生物素与亲和素作用下的双抗体夹心ELISA，用链霉亲和素-生物素化的抗TnT单克隆抗体作包被物，依次于样品中TnT抗原和酶标TnT单克隆的抗体反应，然后加入底物色原。酶催化底物显色，由系列TnT标准制定的校正曲线，定量测定CTnT含量。

2．试剂

(1)生物素亲和素CTnT单克隆抗体包被板。

(2)孵育缓冲液。

(3)浓缩洗涤液。

(4)酶标结合物。

(5)CTnT标准品。

(6)底物色原：ABTS(二氨2．2叠氮)。

3．操作

(1)在包被板中分别加入标准血清、对照血清和患者标本于相应的孔内各50μl。

(2)每孔各加孵育缓冲液50μl，并轻轻混匀。

(3)室温下孵育60分钟后洗涤3次，10分钟内完成。在吸水纸上用力拍打微孔。以除去残留水滴。

(4)每孔各加入酶结合物100μl，轻轻混匀。

(5)倒空微孔板中的孵育液，用洗涤液将微孔洗3次，在吸光纸上用力拍打微孔，以除去残留水滴。

(6)将200μl色原底物溶液加入相应的孔中，避光直射，轻轻混匀，静置30分钟。

(7)用酶标仪在10分钟内，于405nm和630nm双波长下测定吸光度值(OD值)。

4．计算

(1)计算每一标准品、对照血清和患者标本的平均OD值。

(2)以标准品OD值对CTnT浓度绘制校正曲线。

(3)根据校正曲线计算未知样品中CTnT浓度。

5．附注

(1)CTnT待测标本最好用血清，不要用抗凝血浆，因为抗凝剂，如肝素、EDTA等对CTnT有影响。

(2)由于CTnT是心肌细胞损伤释放出来的指标，所以尽量避免标本溶血，如果标本溶血很可能造成检测结果增高。

(3)配制好孵育液不要冷冻保存，应放在2～8冷藏。

(4)实验前应注意试剂有无失效，比如底物色原液如变质，其颜色加深。

(5)为了提高CTnT检测的可靠性，应注意加样及其他操作过程，比色最好选用双波长。

6．参考值<0．1μg/L。

(三)心肌钙蛋白I的ELISA法测定

1．原理双抗体夹心ELISA法。先将抗CTnI单抗包被于微孔板上，加入标准品、患者血清和孵育缓冲液，如果血清中有CTnI，则将与孔中的抗体结合，然后将孔中剩余的样品洗去，加入辣根过氧化物酶标记的CTnI抗体，让酶联抗体与孔中的CTnI结合。这样，CTnl分子就被固相抗体和酶联抗体夹在中间。孵育和洗涤之后，酶反应显色，吸光度OD值与血清CTnI浓度成正比。

2．试剂

(1)抗CTnI抗体包被板。

(2)孵育缓冲液。

(3)浓缩洗液。

(4)抗体和酶结合物。

(5)CTnT标准品。

(6)显色剂A、显色剂B。

(7)2NHCl终止剂。

3．操作

(1)将50μl标准品、对照血清和患者标本加入相应孔内。

(2)将50μl孵育液加入相应的孔中，轻轻混合30秒，此步混匀是关键。

(3)将微孔板放在室温孵育30分钟。

(4)倒空微孔中的孵育混合液，用洗液将微孔洗5次，在吸抽纸上用力拍打，以除去残留水滴。

(5)将100μl酶结合物加入相应的孔中，轻摇混匀。

(6)将微孔板放在室温孵育30分钟。

(7)倒空微孔中的孵育液，用洗液将微孔洗5次，在吸水纸上用力拍打微孔，以除去残留水滴。

(8)将20μlTMB底物溶液加入相应的孔中，轻轻混合5秒，在室温避光条件下静置20分钟。

(9)每孔加入50μl2mol／LNHCl，终止反应，轻轻混合5～30秒以保证蓝色转变成黄色。

(10)用酶标仪在10分钟内，于450nm波长下测定吸光度OD值。

4．计算

(1)计算每一对标准品，对照血清和患者标本的平均OD值。

(2)在坐标纸上绘制吸光度(OD)与CTnI浓度的校正曲线(查看试剂盒内说明书注明的实际CTnI浓度)。

(3)根据校正曲线计算未知样品中CTnI浓度。

5．附注

(1)一套试剂盒最多可做4次检测。

(2)本试剂盒可用于检测血清样品，但不能使用出现肉眼可见的溶血、脂血或浑浊的血清标本。

(3)利用血清标本，应在采集标本后6小时内进行检测，也可将血清冷冻保存于-20℃或更低温度，这样至少可保存3个月，应注意切勿进行反复冻融。

(4)将浓缩的洗液稀释后备用，稀释的洗液可在4下贮存两周。

(5)在孵育缓冲液中稀释具有预期浓度的心肌钙蛋白I的血清进行检测。

(6)用10个孔建立标准品的校准曲线。

(7)全部试剂包括启封的微孔都必须在使用前恢复至室温，未使用的试剂必须贮存于4℃。

6．参考值1．5～3．1μg／L。

7．临床意义

(1)急性心肌梗死(AMI)，发病后血中浓度很快增高，CTnT和CTnI3～6h超过参考值上限值，CTnT10～24小时达峰值，10～15天恢复正常。CTnI14～20小时达峰值，5～7天恢复正常。据报道CTnI在诊断AMI时比CK-MB更为灵敏，但有报道在肾脏疾病患者血样中发现CTnT，所以特异性较差。而CTnI在诊断AMI中更为灵敏，且在肾病及其他疾病患者血液中未发现CTnI，所以CTnI是心脏受损的特异性标志物，可用于评价不稳定心绞痛。另外，CTnI水平升高难度可预示有较高的短期死亡危险性，连续监测CTnI有助于判断血栓溶解和心肌再灌注。由于CTnT和CTnI消失慢，所以，可作为心肌梗死后期标志物。

(2)CTnT和CTnI可作为心脏手术中的心肌梗死症状出现的指示物，当患者接受动脉搭桥手术时，若CTnT和CTnI含量增加，表明出现心肌梗死，而此时CK-MB含量并无变化。

参考文献：

1胡亚美，江载芳，诸福棠实用儿科学.第7版，北京：人民卫生出版社，2002：698~705

2王燕慧，金玉，心肌肌钙蛋白I在儿科的临床应用进展.国外医学妇幼保健分册，2003，14（6）：325~327.

3张丽，王士雯，赵玉生等，心肌肌钙蛋白I在心血管疾病中的应用.中华心血管杂志，1997，25（5）：390~392