OPA/FMOC柱前衍生高效液相色谱法测定细胞培养基M199中氨基酸含量

OPA/FMOC柱前衍生高效液相色谱法测定细胞培养基M199中氨基酸含量

李宏涛

李宏涛（江苏省无锡市美迪生物制品有限公司江苏无锡214000）

【摘要】目的：该实验建立了以OPA/FMOC作为柱前衍生化试剂，采用高效液相色谱法测定细胞培养基中氨基酸含量的方法。在10～180μg.mL-1范围内线性关系良好,相关系数在0.9953～1.000之间,平均回收率95.9%～102.4%,CV%<3.8%(n=5),重复性RSD为0.08%～3.82%(n=6)。结论：该方法准确、灵敏、简便快速，适用于细胞培养基中氨基酸的含量测定。

【关键词】OPA/FMOC柱前衍生法；细胞培养基M199；氨基酸；高效液相色谱

【中图分类号】R90【文献标识码】A【文章编号】1672-2523（2011）04-0135-02

细胞培养基作为细胞工程重要的原材料，其质量的优劣直接影响到生物制品的产量，是生物制品企业非常重视的基础原料。而所有的细胞培养基均含有氨基酸、维生素等必需的营养物质，它们是维持和促进细胞生长、增殖的主要因素。这些物质含量的多少是衡量细胞培养基能否促进细胞生长的重要指标,也是检定培养基是否符合工艺规定的质量指标。因此，确立如何测定培养基中氨基酸的含量是细胞培养基生产厂商保证产品质量的关键工作。

氨基酸的分析方法在近几年已得到了很大的改进和完善，衍生化测定是氨基酸两类分析方法之一[2]。对于各种保健品及复合氨基酸制剂，目前较多的采用PICT柱前衍生试剂测定氨基酸[5][6]。PICT不仅毒性大，且需要专门的衍生装置在无水条件下进行。AQC(6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯)柱前衍生测定氨基酸可以获得较好的结果[4]，但分析时间较长，衍生试剂昂贵且不易购得。OPA和FMOC（邻苯二甲醛一氯甲酸芴甲酯）联用作为衍化试剂具有衍生反应迅速、分析周期检短、检测灵敏度高等特点，且衍生化过程完全自动化操作，使分析效率大为提高。

我们使用HypersilC18分析柱，可变波长UV检测器，OPA-FMOC柱前衍生测定细胞培养基M199中氨基酸含量，自动衍生进样后经梯度洗脱可以在20min内使20种氨基酸完全分离。分离效果，重现性，线性范围均令人满意。

1实验部分

1.1仪器和试剂HP公司1050型高效液相色谱仪、四元梯度泵、自动进样器、可变波长紫外检测器、PhoenixDos化学工作站；分析天平BS210S，赛多利斯；pHS-3C数显pH计，上海雷磁仪器厂；乙酸钠、四氢呋喃和三乙胺为分析纯；乙腈和甲醇为色谱纯；OPA10mg/ml，FMOC2.5mg/ml为HP公司产品；氨基酸对照品为sigma公司产品；细胞培养基M199为无锡市美迪生物制品有限公司产品。

1.2色谱条件色谱柱：HypersilODS柱，5μm，125×4mmid；流动相：A相：取20mM乙酸钠+0.6%四氢呋喃+0.02%三乙胺，用稀醋酸调节PH至7.2。B相：100mM乙酸钠（PH7.2）∶乙腈∶甲醇=100∶175∶225；流速：1.0ml/min；洗脱梯度：0.0-17.0minA相（%）100→40、B相（%）0→60，17.0-18.0minA相（%）40→0、B相（%）60→100；柱温：40℃；波长切换：0-14.5min、338nm，14.5-20min、262nm；衍生化及进样：5.0μl硼酸盐缓冲液+1.0μlOPA液+1.0μl氨基酸液+1.0μlFMOC液按一定程序自动混匀反应后进样。

1.3对照品及样品制备对照品储备液：按M199配方，分别称取各种氨基酸适量，精密称定，用水溶解并稀释至50ml作为对照品储备液。供试品溶液：虽然M199中含有61种成分，但其中可溶性无机盐、葡萄糖、氨基酸占成分的98%以上，且各种难溶成分均通过不同工艺转变为可溶性物质，一些物质又极微量，所以按配制说明制成溶液后，溶液澄清，pH为7.2，可以上机直接测定。

2结果与讨论

2.1线性范围、标准曲线及分离图谱分别精密量取各种氨基酸对照品储备液1、2、3、4、5ml，用水稀释至100ml。按上述色谱条件测定各种氨基酸的线性范围及标准曲线。结果表明，20种氨基酸在一定浓度范围内线性关系良好。精密量取各种氨基酸对照品储备液2ml，置一100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，20种氨基酸的色谱分离结果。

2.2回收率测定按细胞培养基M199配方配制试样，按上述色谱条件连续进样5次，计算各氨基酸的回收率，20种氨基酸的平均回收率范围是95.9～102.4%，RSD<3.8%(n=5)。

2.3重现性试验取2.1项下用于色谱分离的对照品溶液，按上述操作程序连续进样6次，对方法的重现性进行考察。结果表明，20种氨基酸的RSD为0.08%～3.82%(n=6)。

2.4样品氨基酸含量测定精密称取细胞培养基M199约10g，按说明书要求配制成溶液，即为供试品溶液。根据上述色谱条件进行分离分析，经系统适用性实验各氨基酸之间的分离度应大于1.0，以天门冬氨酸计算，理论塔板数应大于3000，采用外标法，将对照品溶液和供试品溶液分别注入色谱仪中。根据对照品溶液的浓度、峰面积和供试品溶液的峰面积，计算供试品中氨基酸的含量。结果各氨基酸组分的含量均在标示量的80%～100%之间。

2.5讨论本方法使用了两种衍生化试剂，可迅速衍生一级、二级氨基酸，使所有20种氨基酸均生成较强荧光和紫外吸收衍生物。自动进样器的使用，方便了衍生化步骤的操作。我们在进样时设置自动混匀程序，在抽取OPA后自动混合20次，抽取FMOC后自动混合30次，衍生化反应完全，分析效率大为提高，也减少了误差的产生。脯氨酸的最大吸收波长在262nm，在338nm处灵敏度较低，因此，我们设定在其他19个氨基酸出峰后切换波长为262nm以提高脯氨酸检测灵敏度。进行梯度洗脱，加快了氨基酸出峰时间，但应注意的是两种流动相的pH需要严格控制在7.20，否则组氨酸与甘氨酸两峰易粘连，使检测误差加大。

细胞培养基的型号较多，含有的氨基酸种类及质量均不相同，我们选取含氨基酸种类最多的M199作为试验对象，通过对M199中氨基酸含量检测方法的建立，也可适用于其他细胞培养基中氨基酸的检测。

参考文献

[1]CheungWKandZhouSL.:AutomaticaminoacidanalysiswithprecolumnderivationonHP1050moduleliquidchromatograph.惠普产品应用指南

[2]丁永胜、牟世芬，氨基酸的分析方法及其应用进展[J].色谱，2004，22（3）210-215

[3]陈鹭颖，OPA-FMOC联用柱前衍生法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量[J].海峡药学，2001，13（4）26-27

[4]张淑香、谭文松等，AQC柱前衍生高效液相色谱法测定动物细胞培养基中氨基酸[J].生命科学仪器，2007，5（4）23-25

[5]姜雯、王棘，柱前衍生化-反相高效液相色谱法测定蛋白粉中氨基酸的含量[J].中国卫生检验杂志，2008，18（2）280-282

[6]胡建鸿、邱利焱等，柱前衍生反相高效液相色谱法同时测定氨基酸保健饮品中16种氨基酸的含量[J].食品科技，2008（10）211-214