分子生物学在耐药基因检测中的应用

分子生物学在耐药基因检测中的应用

刘晓燕1邓德红2王红3

刘晓燕1邓德红2王红3

1.湖北省公安县人民医院检验科；

2.湖北中医药大学医学检验与技术学院在职研究生；

3.湖北省卫生厅公安434300

【摘要】采用分子生物学手段对细菌耐药基因的检测，针对其编码基因的突变及其过度表达，对细菌同源性进行分析，控制细菌耐药流行播散发挥重要作用。

【关键词】聚合酶链反应；核酸杂交；酶切克隆；全基因组测序；指纹图谱分析

【中图分类号】R446.5【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）09-0139-01

20世纪中期开始,分子生物学拉开序幕.从DNA双链结构的发现,限制性核酸内切酶的应用,到DNA测序方法的成熟和PCR技术的诞生,分子生物学的发展使生物医学研究和临床诊断进入了一个新的时代[1]。

近年来，采用分子生物学手段对细菌耐药基因的检测，针对其编码基因的突变及其过度表达，对耐药机制的研究有重要意义。

分子生物学技术在耐药基因检测和定位中的应用主要在以下方面：

1PCR

聚合酶链反应是一种快速在体外从某种来源的模板DNA中扩增目标DNA的通用方法.是最常用的分子生物学技术之一.可用该技术对细菌核酸内已知的耐药性基因进行筛查和验证.利用商品试剂盒从细菌中抽提的基因组、质粒，纯度和浓度均很高，可作为稳定的DNA模板，而通过挑取菌落煮沸裂解直接得到细菌DNA模板，方便快捷，适合大批量地进行耐药基因筛查[2]。引物的特异性以及扩增体系和条件对于PCR的特异性和敏感性非常重要，每次实验中均应包含阳性对照样本和阴性对照样本。

2核酸杂交

核酸杂交是分子遗传学的基础研究工具，利用的是单链核酸分间能退火形成双链分子（也就是杂交）的能力。能形成双链分子的单链分子间必须有高度的碱基互补配对。通常是利用一段被标记的核酸分子作为探针，在许多未经标记的核酸分子混合物中鉴别同源DNA或RNA分子。

通常将细菌菌落直接转移到滤膜上杂交，探针可采用同位素、地高辛或者生物素标记。核酸杂交还可以用于耐药基因定位。将细菌抽提出的质粒通过琼脂凝胶电泳、转膜并用特异性耐药基因探针进行杂交，观察质粒在电泳图上的位置是否存在杂交信号可以判断该耐药基因是否定位于质粒[3]。

3酶切克隆

PCR和核酸杂交只能对已知的耐药基因进行筛查和验证，如果需要寻找未知的耐药基因，可以利用酶切克隆和抗生素筛选的方法。通常对于具有抗生素耐药表型的细菌，首先挑选合适的片段连接入载体（如质粒，噬菌体），通过该耐药表型抗生素筛选重组子可以获得携带耐药基因的质粒，最后对所获得的质粒进行测序明确耐药基因的具体信息[4]。实验的关键点是所挑选的内切酶必须有比较合适的切点，即酶切片段大小要适中，片段太长不易连接入载体，而片段太短则不能包含完整的基因序列导致缺乏耐药表型[5]。

4全基因组测序

随着测序技术在近几年的飞速发展，获得一个物种的全基因组序列已经不是非常困难的事情，特别是相对简单的细菌基因组。明确耐药株的核酸全序列之后，可以在基因组的水平对基因分布、代谢途径、调控通路有一个全局地认识，特别是可以明确耐药基因的进化和传播机制，深入了解目前广泛存在的细菌泛耐药问题。比较传统的方法是先构建全组基因组DNA文库，利用载体克隆大量的文库DNA片段进行毛细血管电泳测序，再将测序片段进行拼接以获得完整的基因组全长[6]。

5RP(RiboprinterDNA)指纹图谱分析系统鉴定对细菌双切酶图谱同源性分析

RP随机配置的数据仅有一种限制内切酶图谱。使用双切酶图谱比较分析的结果证明，通过标准化操作程序得到的酶谱有较好的可比性和重复性，能同时满足鉴定和菌型同源性分析的需要，提高了传统鉴定和分子分型方法的效率，又能通过对疑难菌株的溯源结果建立自主分析数据为库和分子分型应急技术储备，为长效监测分析本地区菌痢等肠道病原的菌型变异等分子流行病学提供科学的依据[7]。

近两年来，基于芯片技术的新的全基因组测序可技术也已兴起。Smith[8]等运用此技术成功地完成了全长3976746个碱基对的鲍曼不动杆菌基因组测序工作。整合子-基因盒系统于1991年由Hall[8]等提出，其是细菌基因组中可移动的遗传物质是细菌的天然克隆与表达携带位点特异性重组系统组分，可将许多耐药基因盒整合在一起从而形成细菌的多重耐药性。研究表明，来自中国、日本和美国[9]的携带qnr（传递质粒编码蛋白）基因的菌株质粒上有多种耐药基因的整合子，整合子定位于转座子上，易在不同菌株间快速传播。李涛等[10]用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法对２２７株大肠埃希菌和３６株克雷伯菌属细菌进行qnr基因检测，结果有６株细菌检出qnr基因（２株大肠埃希菌，１株产酸克雷伯菌，３株肺炎克雷伯菌）。

随着分子生物学技术的不断发展，其在细菌耐药性研究中的应用日益广泛，对揭示细菌耐药性产生及流行的分子机制，控制耐药细菌流行播散发挥日益强大的作用。

参考文献

[1]许敏.美国临床检验医学进展的借鉴.首都医科大学学报,2007,28(2)182-184

[2]CattoirV,PoirelL,RotimiV,etal.MultiplexPCRfordetectionofplasmid-mediatedquinoloneresistanceqnrgenesinESBL-producingenterbacterialisolates.JAntimicrobChemother,2005,49:3091-3094

[3]PoirelL,VanDeLooM,MammeriH,etal.Associationofbeta-lactamaseVEB-1.AntimicrobAgentsChemother,2005,49:3091-3094

[4]HataM,suzukiM,MatsumotoM,etal.Cloningofanovelgeneforquinoloneresistancefromatransferableplasmidinshigellaflexneri2b.AntimicrobAgentsChemother,2005,49:801-803

[5]俞去松.分子生物学技术在细菌耐药性研究中的应用.中华检验医学杂志,2008,31(6):610-613

[6]JinQ，YuanZ,XuJ,etal.GenenomesequenceofShigellaflexneri2a:insightsintopathogenicitythroughcomparisonwithgenomesofEscherichiacoliK12andO157.NucleicAcidesRes,2002,30:4432-4441

[7]HallRM,BrookesDE,StoesHW.Site-specificinsertionofgenesintointegrons:roleofthe59-baseel-ementanddeterminationoftherecombinationcross-overpoint[J].MolMicrobiol,1991,5(8):1941-1953

[8]SmithMG,GianoulisTA,PukatzkiS,etal.NewinsightsintoAcinetobacterbaumanniipathogenesisrevealdbyhigh-densitypyrosequencingandtransposomutagenesis.GenesDev,2007,21:601-614

[9]HataM,SuzukiM,MatsumotoM,etal.Cloningofanovelgeneforquinoloneresistancefromatrans-ferableplasmidinShigellaflexneri2b[J].Antimi-crobAgentsChemother,2005,49(2):801-803

[10]李涛，熊自忠，沈继录.大肠埃希菌与克雷伯菌属细菌QNR基因的检测[J].检验医学，2005，20（2）：112-114