小青龙汤治疗哮喘小鼠的机制研究

小青龙汤治疗哮喘小鼠的机制研究

魏萍

（福建中医药大学附属第二人民医院福建福州350003）

摘要：目的研究小青龙汤是否通过抑制TLR4达到治疗哮喘的目的。方法以卵蛋白建立哮喘模型。随机分为对照组、模型组、小青龙汤组。致敏后，各组分别予生理盐水、生理盐水、小青龙汤灌胃。检测小鼠肺组织中TLR4量。结果模型组TLR4较对照组显著性增加，小青龙汤组较模型组显著性下降。结论小青龙汤可能通过抑制TLR4达到治疗哮喘的目的。

关键词：支气管哮喘小青龙汤TLR4

支气管哮喘是一种由多种细胞和细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，近年，人们对支气管哮喘的发病机制有了新的认识，其中Toll样受体（TLRs）备受关注。TLRs表达于许多的免疫和非免疫细胞，参与多种细胞的迁移，在气道炎症和气道重塑中扮演重要角色。支气管哮喘属于中医哮病范畴，中医分型包括寒哮、热哮、寒包热哮等，临证中以寒哮多见，而小青龙汤出自张仲景的《伤寒杂病论》，自古即为治疗寒哮名方。本研究旨在探讨小青龙汤是否通过抑制TLR4达到治疗哮喘的目的。

1材料与方法

1.1主要试剂

卵清蛋白（OVA），氢氧化铝干粉，兔Anti-TLR4抗体（一抗），羊抗兔抗体（二抗）。

1.2抗原液制备

用生理盐水配制成含OVA（0.05mg/ml）和氢氧化铝（100mg/ml）的混悬液。

1.3小青龙汤制备

麻黄（去节）9g，桂枝（去皮）9g，白芍9g，炙甘草6g，细辛6g，干姜6g，半夏9g，五味子6g。按古方要求用蒸馏水煎汁后用生理盐水配成浓度相当于生药28g/100ml水煎液。

1.4分组

将SPF级，6~8周，体重18~22g小鼠，随机分为对照组、哮喘模型组、小青龙汤组，每组各8只。

1.5造模及药物干预

造模第1天、第7天，在无菌条件下行腔注致敏，第一组给予生理盐水0.2ml，后两组给予抗原液0.2ml；第14~28天，将小鼠置于密闭箱内行超声雾化吸入，第一组给予生理盐水，后两组给予含OVA（10mg/ml）的混悬液，30min/天。每次雾化前，前两组喂食0.5ml生理盐水，小青龙汤组喂食小青龙汤0.5ml。密切观察小鼠生活习性，若小鼠出现躁动、呼吸深快、不主动进食，甚至仰头喘气、呻吟抽搐，即为成功模型。

1.6应用westernblot检测肺组织中TLR4表达水平

称取右肺组织30mg，冰上研磨裂解、离心。根据BCA测定试剂盒说明书操作，在A562下测定，根据标准曲线计算出蛋白浓度。SDS－PAGE电泳，先后用一抗、二抗孵育，于Tanon凝胶成像仪下拍照，获取图片。

1.7外周血皮质醇、血浆葡萄糖检测

末次雾化激发后24h，取50μL股静脉血标本，用化学发光法检测外周血皮质醇水平，葡萄糖氧化酶法检测外周血血浆葡萄糖。

1.8统计学处理

采得数据用SPSS18.0软件包处理，计量资料计以均值±标准差，组间对照用t检验。

2结果

2.1各组小鼠肺组织TLR4总量及外周血皮质醇和葡萄糖的比较：模型组TLR4较对照组显著性增加，小青龙汤组TLR4较模型组显著性减少；模型组血皮质醇较对照组显著性下降，小青龙汤组血皮质醇较模型组显著性升高；三组间血葡萄糖无统计学差异。如表1。

3讨论

小青龙汤全方由麻黄、桂枝、半夏、芍药、干姜、细辛、五味子、炙甘草组成，方中麻黄、桂枝为发汗解表、宣肺平喘之君药，干姜、细辛为温肺化饮兼解表之臣药，半夏燥湿化痰、五味子敛肺止咳、芍药调和营卫共为佐，炙甘草益气和中、调和诸药为佐使，八药共奏发汗解表、温肺化饮之效。现代药理研究表明[1-2]其具有与糖皮质激素一样的抗炎作用，可能通过抑制TLR4的表达进而抑制气道重塑[3]。TLRs是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，与哮喘的关联性研究主要集中在气管平滑肌表达的TLR4，TLR4信号转导通路下分泌的细胞因子可使杯状细胞和腺体增生，分泌物增多，气管壁增厚，气道平滑肌增生[4]。

本研究显示，哮喘组较对照组TLR4表达明显增加，血皮质醇水平低下，小青龙汤干预后TLR4显著减少，而血皮质醇水平升高。因此，我们认为TLR4的高表达可能参与哮喘发病，小青龙汤不但抑制TLR4表达，还增加皮质醇的分泌。

参考文献

[1]陈清阁，张蕾，唐继红，等．小青龙汤对支气管哮喘小鼠磷酸酶基因和基质金属蛋白酶-9的作用[J]．上海医学，2011，34（9）：692—695．

[2]郅琳，胡久略．小青龙汤对支气管哮喘小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞及IL-4，IFN-γ水平的影响[J]．中国实验方剂学杂志，2012，21（11）：265—267．

[3]莫碧文，苏海英，韦江红，等.TLR4、p-Akt在哮喘大鼠气道平滑肌迁移的作用及小青龙汤对其影响[J].中国药理学通报，2011，27（5）：723-728.

[4]KawaiT，AkiraS.Theroleofpattern-recognitionreceptorsininnateimmunity：updatetotoll-likereceptors.NatImmunol，2010，11：373-384.

资助项目：福建省教育厅课题（JA15234）；福建省卫生计生委科研课题（2016-2-35）