大肠杆菌素对抗尿路感染的研究现状与展望

大肠杆菌素对抗尿路感染的研究现状与展望

方克伟

方克伟

（湖南怀化会同人民医院418300）

【摘要】临床上多重耐药菌株普遍出现的重要原因之一是广谱抗生素的普遍使用；大肠杆菌是泌尿外科临床中最常见也是最难治疗的多重耐药菌株之一，如何预防及治疗大肠杆菌的感染、有效避免多重耐药菌株的出现是迫在眉睫的临床问题。大肠杆菌素由大肠杆菌产生，其抗菌谱窄，不易产生耐药性，被视为有效的预防策略之一，很有可能成为新一代的抗菌药物。本文综述了重要的大肠杆菌素作为一种替代手段来预防、治疗尿路各种大肠杆菌相关的感染，分析其抗尿路感染的前景及临床应用所面临的问题。

【关键词】大肠杆菌；细菌素；大肠杆菌素；尿路感染；耐药性【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-7165（2015）01-0047-02

细菌素是由细菌产生的一种蛋白类抗菌物质，为一类抗菌肽，通常只作用于与产生菌同种的其他菌株或亲缘关系很近的菌株[1，2]。

细菌通常会产生毒素来杀灭竞争细菌。大肠杆菌素就是由大肠杆菌产生并对近缘大肠杆菌产生毒性的一种细菌素，通过结构蛋白杀死细菌[3]。现就大肠杆菌素作用机理、临床应用价值与前景、面临的问题等进行文献综述。

1大肠杆菌素的生物学特点大肠杆菌素是由大肠杆菌所分泌的毒性蛋白质，对大肠杆菌及其相近菌种造成毒杀的效果[4]。到目前为止已经描述的大肠杆菌素超过34种，报道较多的是：A、B、D、E1-E9、Ia、Ib、JS、K、M、N、U、5、10等。一般情况下，他们相互作用到敏感细菌包括三个步骤[5]：①大肠杆菌素分子结合到细菌外膜的特定受体上；②通过细胞膜易位；③特定分子对靶细胞的致死作用。大肠杆菌素蛋白质具有3种结构域：运输结构域（主要负责把这种蛋白质转运进靶细胞）、受体结合结构域（主要负责与目标细胞特异受体相结合）、杀伤结构域（主要通过小孔形成和核酸酶产生作用）。当能产生细菌素的细胞开始合成杀伤结构域时，杀伤结构域首先和一种免疫蛋白相结合，这种免疫蛋白在移除之前起作安全帽的作用。杀伤的特异性是由受体结合结构域来决定[6]。不同的大肠杆菌素其作用方式和抗菌效果也不尽相同，而不同的大肠杆菌素组合的抗菌效果也不相同。

2重要大肠杆菌素的抗尿路感染作用由于细菌素是由细菌产生的高度特异的天然抗生素，只对产生细菌素菌株的近缘细菌有毒性作用[7]。人们开始着手研究大肠杆菌细菌素的抗大肠杆菌感染的作用及机理。重要的有以下几种。

2.1大肠杆菌素E2预防导尿管所致尿路感染的作用需要留置导尿管的患者会出现泌尿道病原体慢性感染和尿路感染的复发[8]，而长期留置导尿管会使尿道病原体形成生物膜，这种病原体在尿液中持续种植，细菌定植在生物膜上，对标准抗菌剂有很强的抵抗作用[9]。因此，在长期留置导尿管的患者，抗生素不能有效的防止泌尿道感染，更加不利的是频繁运用抗生素会导致病原体耐药性的出现，以及二重感染[10]。这促使人们寻找新的预防及治疗方法。

有研究在琼脂板上种植K-12，col+，37℃条件下培养过夜，然后暴露在氯仿中杀死该菌，在琼脂平板上覆盖108cfu/ml测试菌株（colS或者colR），培养过夜。结果表明：均匀的涂有ColS的琼脂平板上可见清晰的抑菌带（直径>10mm）出现在K-12，col+接种周围。ColS的抑菌带没有出现在K-12，col-周围，均匀涂有ColR的琼脂平板上亦没有出现抑菌带，证明ColS被质粒阳性K-12所产生的大肠杆菌素E2杀死或者抑制。这说明：大肠杆菌K-12涂在导尿管上其产生的大肠杆菌素E2能完全预防对大肠杆菌素敏感的大肠杆菌在其上面的增殖[11]。

2.2大肠杆菌素K对抗尿路病原性大肠杆菌的作用大肠杆菌素K对致肾盂肾炎大肠杆菌（UPEC）具有明显的抑制活性[12]。大肠杆菌素K是编码细菌形成小的孔隙，造成细菌死亡，有大肠杆菌素ColE1类似质粒的细菌素。菌群中有三个基因编码大肠杆菌素的产生和释放：cka为编码大肠杆菌素的活性，Cki为编码免疫力，ckl为编码细胞溶解[13]。

目前已有实验就大肠杆菌素K的抑菌量及效果进行了研究。大肠杆菌素K在大肠杆菌菌株BL21中表达（DE3）[14]。按照标准实验室的要求分离菌株，UPEC菌株的分离是从尿路感染尿液细菌培养>105CFU/ml。进行5μm的各种浓度（0.1，1，10，和100μg/ml）的大肠杆菌素K在LB平板上进行对UPEC菌株的抑菌实验，在37°C培养过夜后，平板用于检查大肠杆菌素对覆盖菌株的敏感性。

结果表明，共有68%的测试UPEC菌株敏感和32%对大肠杆菌素K耐药。然而，在敏感菌株中，对各种不同敏感性进行观察。结果，18%的菌株由0.1μg/ml抑制，3%的由1μg/ml抑制，16%由10μg/ml抑制，31%由100μg/ml的大肠杆菌素K抑制[12]。基于这些敏感性的不同可能是由于在每个细胞上不同数量的受体[15]。对供试的UPEC菌株，大肠杆菌素K表现出明显的抑制活性。

2.3大肠杆菌素E1是一个潜在的毒力因子目前已经在分子水平上分析了26种大肠杆菌素和9种小菌素，并确定相应的基因。通过检测从泌尿道感染的患者尿液中分离出来的一组361种大肠杆菌和从没有肠道感染的患者粪便中分离出来的对照组中411种大肠杆菌，一共产生了29种细菌素。结果在泌尿道感染组和对照组中分别检测到了17种和20种细菌素。与对照组相比，泌尿道感染组中有更多的大肠杆菌株产生大肠杆菌素E1（分别是22.1%和10.2%，P=0.0008）。更重要的是，在泌尿道感染组中产生大肠杆菌素E1的大肠杆菌具有产生多种细菌素的能力[16]。

在泌尿系统感染组中检测到的361种大肠杆菌其中有195种（54.0%）产生细菌素，这与对照组的细菌素产生率（411种大肠杆菌其中有226种产生细菌素，占55.0%）没有明显的区别。产生单一细菌素与产生两种细菌素的大肠杆菌在泌尿道感染组与对照组中分布相似。

（产生一种大肠杆菌素的大肠杆菌分别为48.7%和45.6%，产生两种细菌素的大肠杆菌的大肠杆菌分别占30.1%和28.2%）。具有编码三种或三种以上细菌素的大肠杆菌在泌尿系统感染组中更常见（与对照组相比分别是20.0%和12.4%，P=0.03）[16]。

根据Jeziorowski和Gordon的研究表明[17]，当大肠杆菌素Ia和小菌素V同时出现，他们被编码在同样的接合质粒上，由于小菌素V操纵子和其他几种基因整合在pColIa质粒上。因此，我们测试了是否相似的整合大肠杆菌素E1基因进入到pColIa可以解释所观察到的大肠杆菌E1和大肠杆菌素Ia合成的关系。在随即挑选的12个大肠杆菌素E1多重产生者里面，所有菌株包含pColE1DNA通过探针互补大肠杆菌素Ia编码DNA不能被识别，反之亦然，表明在泌尿道感染的菌株中pColE1与pColIa不相关。更重要的是pColE1的分子量与以前的研究结果相似，（5.2kb；[18]9kb[19]）表明pColE1DNA不可能编码某种已知的毒力因子。这个研究结果表明在泌尿系统感染的大肠杆菌群中大肠杆菌素E1本身就是一种潜在的毒力因子[16]。

2.4结合不同大肠杆菌素的抗菌效果细菌性菌血症和败血症的出现是一个重要的临床问题。超过40%的菌血症病例，社区获得性和医院获得性，致病性大肠杆菌是引起死亡的主要原因，造成了巨大的经济负担。多数情况下，大肠杆菌败血症继发于尿路感染。

大肠杆菌素的作用要通过不同的受体/转运系统，并表现出不同的作用机制，大肠杆菌素M抑制肽聚糖合成，E6引起rRNA水解，E7裂解DNA，E1和K形成孔隙，对抗一些从尿路起源菌血症患者分离大肠杆菌菌株[20]。已知大肠杆菌产生两种类型的细菌素，根据他们的分子量分为大肠杆菌素（25-80kDa）和小菌素（10kDa）。大肠杆菌素和小菌素有很多相似的地方。与大肠杆菌素相比，小菌素的合成对产生株是非致命的，不是规定的通过DNA损伤诱导SOS系统。此外，几乎所有的大肠杆菌素是质粒编码，而小菌素编码基因也发现在染色体。大肠杆菌素起作用的方式：①使膜通透性增加；②核酸酶活性；③抑制肽聚糖和脂多糖O-抗原合成[21]。他们的活动需要结合外膜特定的受体和通过外膜从机械通道Tol或TonB易位到靶位[22]。还分别测试了联合三种（E7，K，M）和5种大肠杆菌素（E1，E6，E7，K，M）应用的抗菌效果。

研究结果表明，只有组合的大肠杆菌素表现出有效的抗菌活性，排除耐药演变，小菌素可能导致尿路起源大肠杆菌菌血症的发展。

测试分离的大肠杆菌素对抗从尿路起源性菌血症患者105株大肠杆菌菌株，发现大肠杆菌素E7是最有效的，87%的测试菌株易感。

另一方面，32%，33%，43%和53%的测试菌株表现出分别耐大肠杆菌素E6，K，M和E1，对大肠杆菌素不同程度的易感性可能是由于每个细胞的大肠杆菌素受体数目的不同或由于通过脂多糖O-抗原链对受体的保护[23]。大肠杆菌素已被证明对大肠杆菌菌株是有效的，与腹泻相关的包括血清型O157：H7同样有效[24，25]。

对大肠杆菌素不敏感的原因包括：①基因突变，废除或改变大肠杆菌素受体；②由于缺乏大肠杆菌素转运的功能系统。同时在两个或多个的受体/转运系统比一个单一的受体/易位系统更不可能突变。

因此，为了判定是否结合大肠杆菌素使用不同的受体，转运系统和作用方式可以提供有效的抗菌活性，分别结合大肠杆菌素E7，K，M和E1，E6，E7，K，M在随后的24h观察其抑制活性。结合应用三种大肠杆菌素，观察到再生，当新鲜大肠杆菌素仅用于生长周期的开始╨起始，每隔3h在生长周期各处阻止再生。另一方面，当结合五种大肠杆菌素，没有观察到耐药。

此研究表明，同时应用3种或5种大肠杆菌素，能有效地抑制致病性大肠杆菌菌株的生长，并防止出现耐药性[20]。但这些都做的体外抑菌实验，需要用动物实验来证实其在体内作用的效果。

3展望大肠杆菌素具有较窄的抗菌谱，对人体有较高的安全性，大肠杆菌素对致病性大肠杆菌有明确的抑制作用，大肠杆菌素可望被开发为新一代抗菌药物，治疗各种急慢性泌尿系统感染，包括孕期尿路感染，预防医源性导尿管感染及长期使用导尿管的瘫痪患者的尿路感染。大肠杆菌素对治疗细菌耐药性尿路感染的研究有待进一步深入，对大肠杆菌素的研究有望解决尿路细菌感染耐药的难题。然而天然的大肠杆菌素从生物体内直接提取纯化通常产量低、难度大、效率低、难于制备，难于规模化生产。可以试着用基因工程原核表达、纯化提取后进行分析，从而建立生产体系，为新型抗菌药物的生产提供有效的途径，如何提高表达效率、减少成本成为基因工程原核表达技术有待解决的问题。而设想用最简单的组合达到最好的抗菌效果，有待实验得出结论。

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