微透析法研究七叶胆苷抗大鼠脑缺血损伤作用

微透析法研究七叶胆苷抗大鼠脑缺血损伤作用

雷双媛吴苏礼祁永华李光刘国良耿放

（1.黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040）

（2.哈尔滨师范大学黑龙江哈尔滨150025）

（3.药用植物研究所云南分所药理中心云南景洪666100）

【摘要】目的：研究七叶胆苷对局灶性脑缺血脑透析液中谷氨酸（glutamicacid，Glu）和γ-氨基丁酸（gammaaminobutyricacid，GABA）神经递质水平的影响，探讨七叶胆苷对缺血性脑组织损伤的保护作用。方法：SD大鼠分为假手术组（生理盐水1mLkg-1·d-1）、模型组（生理盐水1mLkg-1·d-1）、七叶胆苷组（20mg·kg-1·d-1）和尼莫地平组（2.5mg·kg-1·d-1）。各组每天腹腔注射给药，连续给药7天后，复制大鼠大脑中动脉栓塞模型，进行微透析取样。所得样品经衍生化后，于高效液相色谱仪中测试，比较透析液中氨基酸神经递质的变化。梗死部分经2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色，计算梗死率。结果：七叶胆苷组大鼠脑透析液中谷氨酸和γ-氨基丁酸水平均明显降低，脑梗死率明显降低。结论：七叶胆苷可以通过减少脑缺血后谷氨酸和γ-氨基丁酸的释放，降低脑组织梗死率，起到抗脑缺血的作用。

【关键词】七叶胆苷；脑缺血；微透析；谷氨酸；γ-氨基丁酸。

【中图分类号】R619【文献标识码】B【文章编号】1003-5028（2015）6-0651-02

TheStudyaboutGypenosideagainstCerebralIschemicInjurybyMicrodialysisinRat

LeiShuangyuan1,WuSuli1,QiYonghua1,LiGuang3,LiuGuoliang1,ZhangNing1*,GengFang2*

(1.HeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine，Harbin150040;2.HarbinNormalUniversit,Harbin150025;3.YunnanBranchInstituteofMedicinalPlant,ChineseAcademyofMedicalSciences,Jinghong666100)

【Abstract】Objective：TostudytheeffectsofGypenosideonGluandGABAneurotransmitterlevelsinfocalcerebralischemiacerebralratsbrainmicro-dialysates.Method：Sprague-Dawleyratswererandomlypidedintoshamoperationgroup,modelgroup,Gypenosidegroup(20mg·kg-1·d-1)andNimodipinegroup(2.5mg·kg-1·d-1).Theratsineachgroupwereadministratedbyintraperitonealinjectionfor7days.Themiddlecerebralocclusionmodelwasestablishedonthe7thday,andthebrainmicro-dialysateswerecollected.Thebrainmicro-dialysateswerederivatisedandanalyzedbyHighperformanceliquidchromatographytocomparethechangesofaminoacidneurotransmittersinmicro-dialysates.TheischemicareaswerecalculatedbyTTCstain。Results：TheGluandGABAlevelsinbraindialysatesofGypenosidegroupwerereduced,thecerebralinfarctionpercentageweredecreasedtoo.Conclusion：GypenosidecanreducethereleaseofGluandGABAaftercerebralischemia,decreasethetherateofcerebralinfarction,toplaytheeffectofanticerebralischemia.

【Keywords】Gypenoside;cerebralischemia;microdialysis;glutamicacid;gammaaminobutyricacid.

三七是我国名贵药材,为五加科植物三七(PanaxpseudoginsengWall.var.notoginseng（Burk.）HooetTseng）的根，具有散瘀止血，消肿定痛的功效；可用于咯血，吐血，衄血，崩漏，外伤出血等多种血症。现代药理研究表明，三七要活性成分为达玛烷型四环三萜皂苷，在血液系统、心血管系统、神经系统和代谢系统具有广泛的药理活性，尤其是在抗脑缺血再灌注损伤反面尤为突出[1,2]，其作用机制与清除自由基，抑制钙离子内流，改善能量代谢等多个方面有关[3-5]。

七叶胆苷为三七中达玛烷型皂苷，经国内外学者证实其具有降血脂、抗氧化和抑制凋亡等活性[6,7]，并且对于脑缺血损伤具有一定的保护作用[8]。为了进一步明确其作用机制，笔者对七叶胆苷抗脑缺血活性进行考察，具体如下。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物

雄性SD大鼠，体重260~280g；购于北京维通利华公司提供，许可证号：SCXK（京）2007-0001。

1.1.2药物

七叶胆苷，上海永叶生物科技有限公司；尼莫地平注射液，瑞阳制药有限公司，批号：14081107；复方氯化钠注射液，石家庄四药有限公司，批号：121004402。

1.1.3试剂

2,3,5-氯化三苯基四氮唑，Biotoppend公司，批号：0756；邻苯二甲醛(1,2-Phthalicdicarboxaldehyde，OPA)，上海研域生物科技有限公司，批号：2408B0339；色谱纯甲醇，；水合氯醛，天津光复精细化工研究所，批号：20121104；谷氨酸，Sigma公司，批号：V900450；γ-氨基丁酸，Sigma公司，批号：727350；β-巯基乙醇，Sigma公司，批号：615226。

1.1.4仪器

51600型脑立体定位仪，美国stoelting公司；600型高效液相色谱仪，美国Waters公司；微透析及样品收集装置（CMA/12探针及探针套管、CMA400微透析泵、CMA470冷却微量收集器、CMA/120清醒动物活动装置），瑞典CMA/MICRODIALYSISAB公司；A4级线栓，北京沙东生物科技公司；175-300G大鼠脑切片模具，东莞市捷凯精工电子有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及给药

大鼠32只，随机分成假手术组、模型组、七叶胆苷组和尼莫地平组，每组8只。七叶胆苷组腹腔注射给药20mg·kg-1·d-1，尼莫地平组腹腔注射给药2.5mg·kg-1·d-1，假手术组和模型组每天给予生理盐水1mLkg-1·d-1。

1.2.2造模方法与样品处理

给药3d后，进行套管埋植：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.3mLkg-1）麻醉后，固定于脑立体定位仪上，将探针导管植入纹状体[9]，之后使用牙科水泥固定。

v末次给药后30min，将动物置于清醒动物活动装置中，链接好微透析探头后，开启微透析泵，用复方氯化钠溶液进行灌流，速度为1.5μL·min-1，平衡1.5h后，每20min收集一份样品，收集3份。

麻醉大鼠，使用线栓法[10]建立大鼠局灶性脑缺血模型（MCAO），具体操作如下：大鼠仰卧位固定，行颈正中切口，分离大鼠右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉；动脉夹夹闭颈总动脉，结扎颈外动脉，于颈内动脉剪口，插入线栓，经颈内与颈外动脉分叉处进入颈内动脉，进线长度约18mm。假手术组仅进行颈动脉的剥离和结扎。造模后，待大鼠清醒进行神经功能评分[11]，将评分2分以下的动物剔除，并补充动物重新给药造模。模型合格者，每20min收集一份样品，持续140min。收集完成后，样品于-80℃冰箱冻存，待测。

透析结束后，断头处死大鼠，完整取出脑组织，于-80℃冰箱中冰冻15min，使用大鼠脑切片模具将脑组织切片，置2%浓度TTC溶液中，避光37℃孵育15min后取出。缺血或者梗死部位为白色，正常组织为红色，滤纸吸干水分后，分离按照重量计算脑梗死率：脑梗死率=梗死部分的质量/脑质量×100%。

1.2.3HPLC法测定样品中谷氨酸及γ-氨基丁酸含量

1.2.3.1样品衍生化处理

衍生化试剂的配制：称取邻苯二甲醛30mg溶于750μL甲醇中，加入100μLβ-巯基乙醇，再加入5mL0.1mol·L-1硼砂缓冲液，混匀后，4℃避光保存。

衍生化反应：将透析液或者氨基酸对照品溶液与衍生试剂按照3:1(V/V)比例混匀后，静置2min进样。

1.2.3.2色谱条件

PurospherSTARRP-18(4.6mm×250mm，5μm)柱，激发波长315nm，发射波长457nm；流动相：A为甲醇，B为0.1mol·L-1磷酸二氢钾(Ph=6.5)，梯度洗脱程序：0~5min，20%流动相A，80%流动相B；5~15min，35%流动相A，65%流动相B；15~25min，55%流动相A，45%流动相B；25~30min，20%流动相A，80%流动相B，流速为0.8mL·min-1。色谱图见图1。

图1氨基酸含量测定的高效液相色谱图（A为标准品，B为微透析样品）

1.2.3.3标准曲线的制备

精密称定Glu和GABA，重量分别为14.71mg和10.32mg，加复方生理盐水溶解后定容至100mL，获得1mmol·mL-1标准品储备液，使用时连续稀释获得相应浓度的标准品溶液。

1.2.4统计学方法

所测定指标均采用均数±标准差(±s)表示，使用SPSS19.0软件多组间方差分析进行检验，P<0.05作为差异具有显著性意义。

2结果

2.1标准品线性关系考察和探针回收率

以不同浓度氨基酸标准品进样，测得其浓度与峰面积比的回归方程、线性范围。Glu和GABA的回归方程分别Y=133.15X+30.051，r=0.994；Y=236.42X-80.349，r=0.9997；在1-100μmol·L-1浓度范围内线性良好。Glu和GABA在本次实验中所使用的微透析探针的体外回收率分别为50.1±4.1%、48.3±3.0%。

2.2七叶胆苷对MCAO模型大鼠脑微透析液中Glu和GABA含量的影响

在造模前后，大鼠纹状体细胞外液中Glu和GABA的变化情况如图2和图3。在脑缺血后，氨基酸神经递质的代谢出现紊乱，细胞外液Glu和GABA水平随时间逐渐增高，Glu在脑缺血后100min，达到峰值；GABA在80min前后达到峰值，随后逐渐回落。七叶胆苷的干预，使纹状体细胞外液Glu和GABA时程曲线下移，在40min后，各点神经递质水平均明显低于模型组，差异具有显著性意义（P<0.05或P<0.01）。

4讨论

在脑缺血损伤机制的研究中，Glu在能量代谢失衡后的大量释放所引起的兴奋性毒性，是引起脑神经元凋亡和脑部病理改变的起始环节[12]。GABA为抑制性氨基酸；生理情况下，GABA受体的激活起到抑制兴奋毒性的作用，但其过度激活却对神经细胞有毒性作用[13]。

七叶胆苷的药理活性广泛，包括抗炎、抗氧化、抗癌和降血压等[14,15]，有研究表明七叶胆苷对脑缺血损伤的保护作用是通过抗氧化作用而产生的[8]。但是七叶胆苷类口服生物利用度差，经过胆汁排泄和生物转化后，药效极低[7]。因此，本实验采用腹腔注射给药的方式，直接验证其抗脑缺血的活性，为其前体药物的开发提供依据。

本次实验采用了微透析技术，实时监测了七叶胆苷对于MCAO大鼠脑内氨基酸Glu和GABA释放量变化的影响，并结合TTC染色直观的体现七叶胆苷对于大鼠脑缺血损伤的保护作用。结果表明，大鼠脑缺血后，Glu和GABA水平不断提高；而经过七叶胆苷干预的大鼠脑组织中Glu和GABA水平均明显低于模型组。TTC也表明七叶胆苷可以明显减少脑梗死面率，具有明确的抗脑缺血作用，其作用机制与减少脑内氨基酸的释放，减少神经细胞损伤有关。

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科研项目：

教育部“春晖计划”合作科研项目（Z2010018）

通讯作者：

耿放，（1981-），女，副教授，主要从事中药药效物质基础研究；

张宁，（1974-），男，研究员，主要从事中药药效物质基础及体内代谢研究。