生长因子及生物学材料在组织工程化颌下腺中的应用

生长因子及生物学材料在组织工程化颌下腺中的应用

才越谭学新

才越谭学新（中国医科大学口腔医学院口腔颌面外科教研室110001）

【摘要】生长因子及生物学材料是组织工程的两个主要研究方向。本文阐述了目前组织工程领域研究和应用的一些重要生长因子和生物学材料的主要作用以及近期的实验进展，指出当前应用所面临的问题以及今后的研究方向。

【关键词】生物学材料生长因子颌下腺组织工程

临床上，唾液腺功能低下是一个常见的问题，特别是那些因唾液腺疾病接受一些治疗使唾液腺功能受到不可逆转损伤的患者。头颈部恶性肿瘤和舍格伦综合症是造成这种不可逆的唾液腺功能低下的两个主要原因，这两种情况都对腺泡细胞这个最基本的分泌单位直接杀伤，这样的患者的唾液质和量都会发生很大的变化，唾液腺功能的低下就导致了口腔干燥性疾病的发生，每年全球都会新增50万名干燥综合征的患者，功能低下的唾液腺会对口腔卫生、消化、牙齿健康、粘膜的再生和营养产生恶劣影响，严重影响生活质量，并且这种痛苦会陪伴终生[1]。直到今天，仍然没有一个令人满意的治疗手段能够改善这类患者的生活质量[2]。如今的组织工程研究主要集中在培养出一个经口植入的唾液腺替代品，组织工程学技术就成为这项研究的核心手段[3]。

组织工程的基本原理是将细胞在体外培养扩增后，然后再预先制备完成的生物学支架上进行复合培养，构成细胞-支架复合体，植入机体相应的病损部位，伴随着细胞不断地生长，支架也随之降解吸收，最终形成就有正常生理结构和功能的组织，从而达到器官的再生，这个过程需要三要素，种子细胞、生物学支架和生长信息，具有良好生物学性能的支架是组织工程学研究的基础[4]。随着材料学的发展，以及在研究中对生长因子与细胞相互作用的深入认识，越来越多的生长因子以及更具生物相容性的生物材料应用到颌下腺组织工程中来。

一、生长因子在颌下腺组织工程中的应用

生物因子是在细胞间传递信息并对细胞生长具有调节功能的一些多肽类物质它可以促进或者抑制细胞的增殖分化迁移和基因的表达，近年来在组织工程中有着大量的应用在组织修复过程中为了引导和加快组织的再生而加入。

生长因子的种类包括：1.骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）；2.转化生长因子-1(transforminggrowthfactor,TGF-1)；3.碱性成纤维细胞生长因子(basicfabroblastgrowthfactor,bFGF)；4.胰岛索样生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF-l,IGF-2)；5.血管内皮细胞生长因子(vascularepithelialgrowthfactor,VEGF)；6.表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)；7.神经胶质生长因子(glialgrowthfactor,GGF);8.软骨调节素-I(chondromodulin-I,ChM-I);9.血小板衍化生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF);10.角朊细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor,KGF)。

在颌下腺的组织工程研究中，已经证实了表皮生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子可以促进人类颌下腺细胞的分化，并可以提高淀粉酶促进剂的表达，转化生长因子-b、层粘连蛋白、角化细胞生长因子、神经生长因子，胰岛素、转铁蛋白、刺激分泌的激素，另外转化生长因子b3可以促进鼠颌下腺细胞的分化以及淀粉酶的分泌[5]。

血管内皮生长因子（英文简称：VEGF），是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。人的VEGF蛋白是于1989年由美国的两间生物科技公司的科学家分别成功纯化与鉴定。VEGF有六个等型：VEGF-A,-B,-C,-D,及-E；其分子量从35至44kDa不等，每个等型特异性地与三个“血管内皮生长因子受体”（VEGFR-1,-2,及-3)的特定组合相结合[6]。

在过去的十余年中，许多学者研究了血管内皮因子（VEGF）及其家族成员在血管和淋巴内皮细胞的生长和分化中的重要作用。VEGF是正常和异常血管新生的重要的调节因子，在生理性血管新生中起重要作用。VEGF正在进行广泛的临床实验研究。VEGF也是增加血管通透性的物质之一。微血管对蛋白的通透性的增加是血管形成的关键。血浆蛋白的漏出和血管外纤维蛋白基质的形成为内皮细胞生长、迁移所必需的[7]。

目前已有血管内皮生长因子应用于口腔颌面部骨组织工程中的相关报导，动物实验已证实血管内皮生长因子对颌骨牵张成骨和颌骨缺损修复起着促进作用。

在先前的研究中建立人、鼠、猪等的涎腺上皮细胞的培养方法，进行了三方面的改进，包括：1、添加有利于上皮细胞生长和分化的因子（如表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白、刺激分泌的激素）或改变钙离子浓度等。2、在培养皿中铺以底物（如胶原、Matrigel鼠EHS可移植性肿瘤基底膜提取物、纤维粘连素、层粘连素及明胶等）不仅可以促进细胞贴壁，减慢终末分化，如铺较薄的细胞外基质是涎腺细胞呈单层生长，较厚时可呈现三维立体结构的生长。3、无血清或低血清含量培养法，选用基础培养液Dulbecco,s改良培养基（Dulbecco,s

ModificationofEagle,smedium,DMEM)或是无血清培养液MCDB-153。培养液中需加入有利于上皮细胞生长的因子。低浓度血清有利于上皮细胞的生长。高浓度血清有利于成纤维细胞的生长，无血清或低血清浓度的条件下，成纤维细胞贴壁受到抑制，有利于减少细胞培养中的成纤维细胞污染。

二、组织工程学材料与颌下腺细胞

颌下腺组织是高度分化组织，一旦损伤则难以修复，常规方法治疗无明显疗效。近年来随着组织工程技术的逐步成熟，为颌下腺修复提供了可能。颌下腺组织工程有其特殊性，虽取取得一定进展，但在细胞培养、载体材料选择及组织工程化颌下腺的培养及植入研究中均有较多问题亟待解决[8]。

目前颌下腺组织工程化组织的构建方式有三种：支架材料+种子细胞；支架材料+生长因子；支架材料+种子细胞+生长因子。目前这三种方式的组织工程技术在软骨、皮肤、肌腱、胰腺、肝脏、血管等组织方面已得到较广泛的研究和应用。

支架材料+种子细胞+生长因子复合物是完全工程化的组织复合体，旨在体外把种子细胞、细胞支架有促进细胞转化的生长因子重组在一起并植入体内而获得再生的目的组织。生长因子在组织工程系统中的应用方法多种多样[9]。

目前尚未找到理想的涎腺组织工程种子细胞及支架材料，但很多学者已做了不少体内、体外的复合培养研究并取得了有意义的成果。Sun等[10]将小型猪涎腺细胞接种于生物可降解材料上发现，细胞粘附生长在支架材料上，并保持了分泌a-淀粉酶的活性。周青等[11]通过将大鼠颌下腺细胞接种于胶原海绵材料支架发现，细胞接种后第1周细胞分散于材料表面，无细胞突起形成；第2周细胞数量有所增加、细胞突起形成并锚定于胶原海绵表面；第3周时附着的细胞数目增多，可见细胞表层有丝状纤维形成。免疫组织化学染色观察复合培养的颌下腺细胞上皮细胞特异性抗体CK8。呈强阳性，肌上皮细胞特异性抗体a-SMA染色呈阳生。透射电镜下颌下腺上皮细胞表面可见微绒毛、胞浆皱褶和细胞顶部的酶原颗粒，胞核大卵圆形，胞质内见线粒体和粗面内质网。随着接种后培养时间延长，与胶原海绵复合培养的颌下腺细胞分泌的淀粉酶含量有不同程度的增加BuchelerM等将体外培养的人涎腺细胞种植在微载体（micorcarriers）-ctodex3,ctodex1上，进行体外培养研究，3周后对细胞培养的上清液淀粉酶的检测为阳性，对细胞进行的淀粉酶，角蛋白的免疫检测也为阳性。这种微载体中也能够分化。

Joraku等[12]将人涎腺上皮细胞应用组织块培养法在无血清角质细胞培养基(Ker-atinocteSFM)中培养后接种在可降解生物材料聚乙醇酸（Polyglyc-olicacidpolymers）上，再将细胞/支架材料植入裸鼠皮下，分别于2周、4周、8周后取出进行细胞表型及功能检测，免疫组化及Westernblot检测发现人α-酶、cytokeratinsAE1/AE3及aquaporin-5表达阳性。RT-PCR检测证实了a-淀粉酶mRNA表达阳性。此实验表明涎腺细胞和支架复合物在体内能够构建有功能的涎腺组织。之后，Joraku等[13]双在体外成功构建了有分泌功能的三维立体结构的涎腺分泌单位。他们将人涎腺细胞培养扩增后将单细胞悬液植入由胶原及基质胶构成支架的三维培养系统中，观察细胞形态变化，进行细胞表型及分泌功能检测。发现在胶原及基质胶存在的条件下，单一的人涎腺细胞可以分化增殖并形成了有三维立体结构的腺泡及导管结构。所有的涎腺样结构都检测到有淀粉酶分泌并且有关键的水通道蛋白（Aquaporin-5）表达，各种培养条件下都检测到了细胞间紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin及claudin-1，在透射电镜下可以观察到桥粒、微绒毛及细胞内分泌颗粒。实验结果显示，单一的腺泡细胞可以在适当的条件下分化增殖形成具有腺泡和导管结构的相对完整的有分泌功能的涎腺分泌单位[14]。

综上所述，组织工程化颌下腺的研究目前仍处于起步阶段，如何构建一个由外分泌功能的颌下腺组织，不仅在种子细胞，支架材料的选择，构建具有盲管的树枝装支架结构等方面需要进一步深入研究，支架材料的制造应运而生及生长因子对细胞的在支架上生长的促进作用也是值得研究的课题，而血管内皮生长因子是值得期待的又一研究课题，旨在为构建功能性的颌下腺组织提供另一方面的依据。

参考文献

[1]JorakuA,SullivanCA,YooJJ,etal.Tissueengineeringoffunctionalsalivaryglandtissue.Laryngoscope.2005:115(2):244-248.

[2]FoxPC.Acquiredsalivarydysfunction:Drugsandradiation.AnnNYAcadSci.1998:842:132-137.

[3]俞光岩；前言[A]；第三次全国涎腺疾病学会议论文汇编[C]；2006年．

[4]O'SullivanB,AslanidisJ,KrollB,etal.APhaseIIIplacebo-controlledtrialoforalpilocarpineinpatientsundergoingradiotherapyforhead-and-neckcancer.IntJRadiatOncolBiolPhys.20021;54(1):9-13.

[5]黄绍辉,谭学新,周青．EGF对颌下腺导管细胞增殖作用的影响．临床口腔医学杂志.2004;20(2):67-69．

[6]BussolinoF,MantovaniA.PersicoG.Molecularmechanismsofbloodvesselformation.TrendsBiochemSci.1997;22:251-256.

[7]OlfertIM,BreenEC,Mathieu-CostelloO,etal.Chronichypoxiaattenuatesrestingandexercise-inducedVEGF,flt-1,andflk-1mRNAlevelsinskeletalmuscle.JApplphysiol.2001;90(4):1532-1538.

[8]周青.肝细胞生长因子对大鼠颌下腺细胞增殖的影响.中华实验外科杂志.2002;9:540-541.

[9]MaedaM,KadotaK,KajiharaM,etal.Sustainedreleaseofhumangrowthhormone(Hgh)fromcollagenfilmandevaluationofeffectonwoundhealingindb/dbmice.JControlRelease.2001;77(3):261-272.

[10]SunT,ZhuJ,YangX,WangS.Growthofminiaturepigparotidcellsonbiomaterialsinvitro.ArchOralBiol.2006;51(5):351-358.

[11]周青,朱耀旻，邓春富,王玉新.组织工程颌下腺细胞与胶原海绵复合培养的实验研究.中国修复重建杂志.2007;21(2):160-164.

[12]JorakuA,SullivanCA,YooJJ,AtalaA.Tissueengineeringoffunctionalsalivaryglandtissue.Laryngoscope.2005;115(2):244-248.

[13]JorakuA,SullivanCA,YooJ,AtalaA.In-vitroreconstitutionofthree-dimensionalhumansalivaryglandtissuestructures.Differentiation.2007;75(4):318-324.

[14]AframianDJ,CukiermanI,NikolovskiJ.Thegrowthandmorpho-logicalbehaviorofsalivaryepithelialcellsonmatrixproteincoatedbiodegradablesubstrata.TissueEngineering.2000;6(3):209-216.