HPLC法测定人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松尿样提取方案优化

HPLC法测定人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松尿样提取方案优化

万隽张晓光陈瑶

万隽张晓光陈瑶(厦门市妇幼保健院药学部361003)

【摘要】解析高效液相色谱法分离人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松中尿样处理方案，研究改进思路，建立适合大样本研究最佳提取条件。

【关键词】6β-羟基氢化可的松氢化可的松高效液相色谱法尿液提取

药物代谢的主要场所是肝脏，肝脏进行生物转化最主要的酶系为细胞色素P4503A（CYP3A），该酶系基因的多态性对药物代谢的影响已得到证实[1,2]。测定CYP3A的活性，可以达到“用药个体化”的目的，使患者获得最佳治疗效果[3,4]。氢化可的松是内源性的糖皮质激素,体内经CYP3A4代谢为6β-羟基氢化可的松,人尿中6β-羟基氢化可的松和氢化可的松比值可作为理想的体内非损伤CYP3A酶探针。采用高效液相法侧定尿液中尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松的含量，是目前较常用的一种方法[5]。但尿液中含有多种内生物质，给6β-羟基氢化可的松和氢化可的松的分离带来一定困难。通过改进尿样的处理方法，减少杂质干扰，有利于提高两种待测物质分离度。本文将就尿样的提取方案做一简介。

1流动相选择

1.1流动相构成

A相：甲醇/乙腈

B相：硫酸铵/醋酸铵/磷酸盐缓冲盐（PBS）/水

1.2流动相选择

HPLC流动相选择中一般以有机相和水或缓冲液体系搭配而成，通过两者比例调配达到待测物质色谱峰最合理的分离效果。如果得到的色谱图出的峰分不完全，可以加大水的比例；如果出峰太靠后而分离效果又不错，可加大甲醇的比例。因此，为缩短检测时间，可采用梯度洗脱的方式。文献中记载在前6min中采用A相：10%、B相：90%，目的就是加快待测物质洗脱出柱的速度；在6min-28min，则采用A相：35%B相：65%的流动相比例，是为了将待测物质色谱峰更好的分离，得到更好的色谱图形。

一般C18色谱柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；因此，为保证流动相PH值在合理的范围内，对于B相多采用缓冲盐体系。但经常使用缓冲液固定相要降解，一旦发生上述情况，色谱柱入口处会塌陷。缓冲液中PBS由于配置后久不用易滋生霉菌，与新华医院药剂科的老师交流后认为使用硫酸铵或醋酸铵缓冲盐溶液较好。B相在上柱前均因通过0.45um滤膜过滤，以免杂质堵塞色谱柱。同样，为防止缓冲盐在色谱柱中析出结晶，检测完毕后，应先用水洗柱1小时，在用甲醇洗柱1小时，以保护色谱柱。

2尿样处理

2.1尿样处理法

液相提取法

原方法优化，缩减步骤，减少操作

①取2-5ml尿样，加入4ml乙酸乙酯-乙醚（4:1）混合液提取；

②漩涡振荡2-10min；

③10000rpm/min离心10min；

④去水相，有机相挥干，100ul甲醇溶解，进样20ul检测。

固相萃取法

蛋白沉淀法

①1ml尿样中加入200ul10%三氯乙酸或1ml尿样中加入2ml甲醇进行蛋白沉淀；

②漩涡振荡2-10min；

③10000rpm/min离心10min；

④上清液进样。

2.2方法比较

3方法选择

对于尿样的提取，如用蛋白沉淀法方法简便，普通操作者对步骤稍加熟悉即可上手，同时样本处理的平行性和结果重现性较高，对实验室要求也较低，适合开展。区别于提取法，沉淀法处理尿样中待测有效物质含量较低，对色谱柱分离要求较高。此外，沉淀剂中三氯乙酸对色谱柱有一定的损害，如选用甲醇沉淀，甲醇与尿样比例需为2:1，稀释后的尿样检测限度更低，不利于测定。同时，大样本尿样检测后，尿样中杂质容易堵塞色谱柱，需经常对色谱仪过滤塞进行更换。

文献[6]中采用的液相提取方法，虽然操作步骤繁琐，但能有效消除尿样中其他杂质影响，样本处理平行性和结果重现性较好，通过提取条件优化，减少提取步骤，同样也适用的大样本处理。综合分析，各种方法都有利弊。本课题更倾向于液相提取法法，该法通过优化后简便易上手，平行性与重现性较高，对实验设备要求较低，适合大样本检测工作开展。另外，该法的实验成本也在我们课题经费所能承受的范围之内，适合本课题研究。

参考文献

[1]黄敏，汪晖，平洁，等.中国大陆汉族人群CYP3A4基因变异分析[J].中国临床药理学与治疗学，2006，11（3）：54.

[2]高玫梅，邓维意，陈盛强，等.人CYP3A4第9外显子基因突变频率的检测[J].中华生物医学工程杂志，2005，11（5）：24.

[3]BakerSD,vanSchaikRH,RivoryLP,etal.Factorsaffectingcy-tochromeP-4503Aactivityincancerpatients[J].ClinCancerRes,2004,10(24):8341.

[4]TanakaT,OkudaT,YamamotoY.CharacterizationoftheCYP3A4activesitebyhomologymodeling[J].ChemPharmBull,2004,52(7):830.

[5]陈娜，姚兵.高效液相梯度洗脱法侧定血清中氢化可的松和可的松的含量[J].徐州医学院学报，2003，23(2):107-110.

[6]张顺国，陈敏玲，唐跃年.高效液相色谱法测定尿液中氢化可的松及6β-羟基氢化可的松的含量[J].中国医院药学杂志，2004，24（12）：733.