富马酸替诺福韦二吡呋酯片体外溶出度的测定

富马酸替诺福韦二吡呋酯片体外溶出度的测定

王小雷1程周

江苏豪森药业集团有限公司研究院，江苏连云港222069

[摘要]目的HPLC法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯片的体外溶出。方法采用《中国药典》2015年版溶出度测定第二法，以pH1.0的盐酸溶液900ml为溶出介质，转速50r/min，溶出时间为60min。使用HPLC法对溶出样品检测，采用XBridgePhenyl色谱柱（150×4.6mm,3.5um）；流动相：0.05mol/L乙酸铵缓冲液（pH4.6）-乙腈（80︰20,V/V）；流速：1.0ml/min；检测波长：260nm；柱温：25℃；进样量：10μl。结果本方法平均回收率99.70%（n=9）；在33~530μg/ml范围内线性关系良好。结论方法简便、灵敏、准确、专属性强；可用于富马酸替诺福韦二吡呋酯片溶出度的检测。

[关键词]富马酸替诺福韦二吡呋酯；高效液相色谱法；溶出度

富马酸替诺福韦二吡呋酯（Tenofovirdisoproxilfumarate，TDF）是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，由美国吉利德（GileadSciences）公司研发，商品名为VIREAD。美国FDA分别与2001年和2008年批准其用于治疗艾滋病（HIV）和成人的慢性乙型肝炎（chronichepatistisB，CHB）[1-2]。2014年TDF被中国食品与药品监督管理局批准用于CHB患者抗病毒治疗。将给中国的CHB患者带来新的治疗选择，使更多乙肝患者从中获益。本课题通过对参比制剂研究，处方研究及工艺优化，制备富马酸替诺福韦二吡呋酯片。作为口服固体制剂，溶出度通常作为一项关键质量属性[3-4]。因此，本文参考相关指导原则[5-6]，建立了可快速、准确检测富马酸替诺福韦二吡呋酯片溶出样品的高效液相色谱法，并通过对其溶出行为的考察，确定了其溶出条件。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent1200系列高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；RCZ-8M溶出试验仪，天大天发科技有限公司；R200D天平，德国Sartorius公司；

富马酸替诺福韦二吡呋酯对照品（批号︰RS20160512，纯度100.0%），江苏豪森药业集团有限公司；VIREAD（批号：A852203），吉利德；富马酸替诺

福韦二吡呋酯片（300mg/片，批号20160801），自制；色谱纯磷酸、TEDIA公司；色谱纯乙腈，MERCK公司；分析纯盐酸、醋酸钠、冰醋酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、乙酸铵，国药集团化学试剂公司；纯化水，自制。

1.2溶出度测定方法的建立

1.2.1色谱条件与系统适用性

色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.05mol/L乙酸铵缓冲液（pH4.6）-乙腈（97:3）为流动相A，0.05mol/L乙酸铵缓冲液（pH4.6）-乙腈（40:60）为流动相B，以流动相A-流动相B（20:80）为流动相；流速：1.0ml/min；检测波长：260nm；柱温：25℃；进样量：10μl。在该色谱条件下，理论塔板数按富马酸替诺福韦二吡呋酯峰计算约为6500，不低于2000。

1.2.2对照品溶液配制

取富马酸替诺福韦二吡呋酯对照品约33.3mg，精密称定，置100ml量瓶中，用0.05mol/L乙酸铵缓冲液（pH4.6）-乙腈（80︰20）溶液超声溶解，摇匀。分别用0.1mol/L盐酸溶液、0.01mol/L盐酸溶液、pH4.5醋酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液及水定量稀释制成每1ml约含C19H30N5O10P333μg/ml的溶液，作为对照品溶液。

1.2.3供试品溶液配制

照溶出度与释放度测定法（中国药典2015年版四部通则0931第二法），分别选择900ml的0.1mol/L盐酸溶液、pH4.5醋酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液和水为溶出介质，转速为50转/分钟，依法操作；经5、10、15、30、45和60min时，取溶液10ml，同时补充同温的溶出介质10ml，经滤膜过滤，弃去初滤液5ml后，取续滤液，作为供试品溶液。

1.2.4溶出介质的配制

（1）pH1.0（0.1mol/L盐酸）：取盐酸9ml，加水稀释至1000ml，摇匀，即得；

（2）pH4.5缓冲液：取醋酸钠18g，加冰醋酸9.8ml，再加水稀释至1000ml，摇匀，即得。

（3）水：公司自制的纯化水。

（4）pH6.8缓冲液：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。

1.3溶出度条件筛选

1.3.1溶解度的测定

取“1.1”项下富马酸替诺福韦二吡呋酯对照品适量，分别加pH1.0、pH2.0、pH4.5、水、pH6.8缓冲液适量，置37℃恒温振荡器中振摇24h，使之形成过饱和溶液后取样，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液按“1.2.1”下色谱条件测定。

1.3.2溶液稳定性

取“1.1”项下富马酸替诺福韦二吡呋酯对照品适量，分别加pH1.0、pH2.0、pH4.5、水、pH6.8缓冲液适量，超声溶解，摇匀。经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液按“1.2.1”下色谱条件测定0、2、4、8、12、24h的峰面积。

1.3.3溶出度转速的筛选

取“1.1”项下富马酸替诺福韦二吡呋酯片，按照《中国药典》2015年版四部第二法，以0.1mol/L盐酸900ml为溶出介质，转速分别为50r/min、75r/min。依照“1.2.3”项下进行实验操作及样品处理，制备供试品溶液。

1.4溶出度测定

1.4.1供试品制备

参照“1.2.3”项下溶出度检查法及样品处理方法，以四种不同pH溶出介质测定自制制剂与参比制剂的溶出，于5、10、15、30、45、60min取样10ml，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，同时补加同温度等体积的溶出介质。

2结果

2.1溶出度测定方法学验证

2.1.1专属性

按照“1.2”项下方法配制对照品溶液、供试品溶液、空白辅料、空白介质溶液及流动相，分别进样分析。主药富马酸替诺福韦二吡呋酯保留时间约为2.3min，空白辅料和溶剂在该保留时间附近未出峰，对主药的测定无干扰。

2.1.2标准曲线

分别精密称取对照品适量，依次用pH1.0、pH4.5、水、pH6.8缓冲液稀释成浓度依次为33、130、270、330、400和530μg/ml的标准溶液。分别进样分析，记录色谱图，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得回归方程分别是Y=12053.2X+97.9921，(R2=0.9993,n=3)；Y=12101.5X+96.0981，(R2=0.9993,n=3)；Y=12066.8X+98.3387，(R2=0.9992,n=3)；Y=12094.2X+88.6341，(R2=0.9994,n=3)，见图1。表明富马酸替诺福韦二吡呋酯在33～530μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.1.3回收率

分别按处方量80%、100%、120%称量空白辅料于100ml容量瓶中，量取适量溶出介质加入其中，超声使辅料溶解，放冷至室温；精密称取对照品26.666mg、33.333mg、40.000mg加入上述溶液中，并以溶出介质稀释至刻度，摇匀，制得理论浓度为266.66、333.33和400.00μg/ml的三种溶液，依法平行配制各3份，过滤，取续滤液进样分析，记录色谱图。按外标法以峰面积计算实际检出量，并计算其回收率，结果见表1，平均回收率为99.70%，回收率均在98%-102%之间。本法回收率符合要求，空白介质及辅料对溶出主成分检测无干扰。

2.1.4进样重复性

制备供试品溶液，连续进样6次分析，记录色谱图，富马酸替诺福韦二吡呋酯检测含量的RSD为0.03%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.1.5检测限和定量限

取对照品溶液，用稀释液逐级稀释，进样分析，记录色谱图。测得富马酸替诺福韦二吡呋酯的检测限（LOD）为0.01μg/ml(信噪比S/N约为3)。富马酸替诺福韦二吡呋酯的定量限（LOQ）为0.02μg/ml(信噪比S/N约为9)。

2.2溶出条件筛选

2.2.1溶解度的测定

按照“1.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“1.2.2”项下方法制备对照品溶液，依法操作，分别计算富马酸替诺福韦二吡呋酯在不同pH值溶液中的平衡溶解度，结果见“表2”。富马酸替诺福韦二吡呋酯表现为高溶解性，在不同pH值溶液中均满足漏槽条件，同时其溶解度随着溶液pH增大而降低。

2.2.2溶液稳定性

按照“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，测定了富马酸替诺福韦二吡呋酯在不同pH介质中24h的溶液稳定性。以0时峰面积按100%作对照，测定了2、4、8、24h的峰面积，并与0时进行对比。实验结果表明：富马酸替诺福韦二吡呋酯除在pH6.8介质常温下不稳定，需要控温在4℃条件下，在其他pH介质中4h内稳定性良好。

2.2.3溶出转速的筛选

按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“1.2.2”项下方法制备对照品溶液，按照“2.2.1”项下方法进行样品检测及数据处理。实验结果表明：富马酸替诺福韦二吡呋酯片在桨法50r/min和75r/min转速条件下，15分钟均达到100%溶出。参考相应指导原则，选用桨法、转速为50r/min。

2.3溶出度测定

2.3.1不同pH溶出曲线绘制

按照“1.4.1”项下方法制备供试品溶液，按照“1.2.2”项下方法制备对照品溶液，在规定色谱条件下分别进行色谱分析并记录色谱图和峰面积，按照外标法计算富马酸替诺福韦二吡呋酯片的累积溶出度，并绘制溶出曲线，其结果见图1，由结果可知，本品在在0.1mol/L盐酸溶液、pH4.5醋酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液和水四种溶出介质中10分钟溶出大于85%，15分钟基本完全溶出；且本品为速释制剂，主要释放部位为胃部，选择0.1mol/L盐酸溶液为溶出介质。自制制剂与参比制剂溶出相似性符合要求。

3讨论

本文建立了富马酸替诺福韦二吡呋酯片的溶出度检测方法，经方法学验证，方法专属性、线性和回收率良好，各项结果均符合方法学验证的标准；同时对其溶出条件进行筛选，可为富马酸替诺福韦二吡呋酯片的溶出度检测方法提供参考。

【参考文献】

[1]朱跃芳，姚亮元，林芳.反相高效液相色谱法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯原料药7种有关物质含量[J].中国药业2019，28（6）26-28

[2]乐晓琴，张仁芳.富马酸替诺福韦二吡呋酯对艾滋病患者肾脏毒性的研究进展[J].新发传染病电子杂志2018，3（3）150-152

[3]张宁.普通口服固体制剂溶出度试验研究中需关注的问题[J].中国新药杂志2013，22(22)：2607-2609.

[4]谢沐风.如何科学、客观地制订溶出度试验质量标准[J].中国医药工业杂志2012，43(3)23-32

[5]国家食品药品监督管理局组织编写.药物研究技术指导原则.[M]北京：中国医药科技出版社，2005，48-55

[6]国家食品药品监督管理局组织编写.药物研究技术指导原则.[M]北京：中国医药科技出版社，2005，63-76