微血管密度和层粘连蛋白在脑胶质瘤组织中表达及相关性研究

微血管密度和层粘连蛋白在脑胶质瘤组织中表达及相关性研究

郭炜1陆永建2郝卓芳2廖德贵2李珺1

郭炜1陆永建2郝卓芳2廖德贵2李珺1

(1广州医学院第三附属医院510150;2广州医学院第二附属医院510260)

【摘要】目的探讨人脑胶质瘤中层粘连蛋白(LN)的表达与微血管密度(MVD)和肿瘤良恶性程度的关系。方法用免疫组织化学染色方法检测手术切除石蜡包埋的50例人脑胶质细胞瘤(Ⅰ-Ⅱ级17例为一组，Ⅲ-Ⅳ级33例为一组)组织中的LN表达情况和MVD计量；另外，取脑外伤及自发性脑出血开颅减压术中切除的正常脑组织8例作为对照组。结果①LN在胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织对照组（X2=6.497,p<0.05）；②各级别胶质瘤组织中均有LN表达，主要表达于胶质瘤血管内皮基底膜中及部分胞浆中，低级别胶质瘤（Ⅰ级和Ⅱ级）17例，LN表达阳性率为64.7%；高级别胶质瘤（Ⅲ级和Ⅳ级）33例，LN表达阳性率为88.65%。LN在高度恶性的胶质瘤中的表达显著高于低级别胶质瘤（p=0.0278，p<0.05）；③高级别胶质瘤（Ⅲ级和Ⅳ级）与低级别胶质瘤两组MVD有显著性差异（rs=0.4139,p<0.01）；④LN的表达与MVD相关（F=5.136，p＜0.01)。结论①LN在脑胶质瘤血管生成中起重要作用，能促进胶质瘤血管的形成；②LN和MVD与胶质瘤良恶性程度明显相关，可作为脑胶质瘤病理诊断的补充指标；③LN可作为治疗脑胶质瘤的靶向目标，为胶质瘤的基因治疗提供指导方向。

【关键词】层粘连蛋白微血管密度胶质瘤免疫组织化学细胞外基质

【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）02-0118-03

人类肿瘤的生长、浸润、转移和复发是受一系列因素的调控及相互影响的结果，其中促使肿瘤细胞趋化、粘附和迁移以及肿瘤新生血管形成的因素起着十分重要的作用。脑肿瘤的发病率约为每10/10万/年；其中胶质是常见的恶性肿瘤，约占全部原发脑肿瘤的35.26-60.96%（平均44.69%）[1]。由于胶质瘤以浸润方式生长发育，与正常脑组织无明显界限，因而手术完全切除困难。虽然化疗、放疗等辅助治疗能改善部分患者的预后，但总体疗效不佳，患者的2年生存率不足30%，而且目前对此尚无确切有效的治疗措施。不管胶质瘤细胞的起源和分化程度如何,它的主要生物学特性都表现为广泛的局部侵袭而罕见颅外转移，有报道表明单个的胶质瘤细胞可以迁移到距离原发肿瘤团块4.0～7.0cm的地方[2]，而且它的侵袭特性与胶质瘤的恶性程度无关,即使低级别的胶质瘤也表现为广泛的侵袭性生长。肿瘤血管的生成是肿瘤生长和转移的必要条件。通过血管，肿瘤细胞可获得呈指数级的分裂和侵袭能力。LN是血管基底膜的主要成分，也是细胞外基质(extra-cellarmatrix，ECM)的主要成分，它具有影响细胞的粘附、迁移的重要作用，有多种重要而复杂的生物学功能[3]，在肿瘤血管生成的早期起着一定的作用[4]。本研究通过免疫组化检测脑胶质瘤中LN的表达和微血管标记后定量计数情况进行分析，探讨它们与脑胶质瘤生长及患者预后的关系。

材料与方法

一、材料

1.临床资料：随机收集广州医学院第二附属医院神经外科自2009年1月至2010年1月病理证实为脑胶质瘤的50例手术患者临床病理资料作为研究组，包括男31例，女19例，年龄范围6岁–72岁，平均36.66岁，男：女=31:19。所有标本用10%福尔马林固定，石蜡包埋，H.E.染色常规病理诊断。按2000年WHO关于神经系统肿瘤的分类及分级标准[2]进行分类和分级，其中胶质细胞瘤Ⅰ级9例；胶质细胞瘤Ⅱ级8例；胶质细胞瘤Ⅲ级20例；胶质细胞瘤Ⅳ级13例；小脑、桥脑星形细胞瘤7例；大脑星形细胞瘤43例。并对每例患者术后进行随访，记录生存时间。随访时间2～36月，平均(16.4±9.1)月。对非本疾病引起的死亡病例排除在外，本研究组中死亡患者均由本疾病所致。另取8例正常脑组织（取自颅脑外伤或自发性脑出血手术切除的非肿瘤脑组织）作为正常对照组。

2.主要试剂：鼠抗人LN单克隆抗体及鼠抗人CD34单克隆抗体，均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

二、方法

1.SP免疫组化：依据患者姓名及病理号从广州医学院第二附属医院病理科调出福尔马林固定、石蜡包埋的标本，4µm连续3张切片。1张行苏木精-伊红染色，按WHO标准核实或修改病理诊断；另2张行免疫组化染色。

免疫组化步骤：先将切片脱蜡水化，0.01mmol/LpH6.0的枸橼酸盐缓冲液中热引导抗原修复15min，3%双氧水室温孵育10min，一抗工作液(LN原液按1：50稀释，CD34原液按1：50稀释)4℃过夜(>12h)，第2天加二抗室温孵育20min，再加辣根酶标记的SP室温孵育30min，最后镜下控制DAB显色，苏木精对比染色，脱水，透明，中性树脂封固，镜下观察，计数评分，拍照。

2.对照实验：用已知的乳腺癌组织做阳性对照,LN为自身对照,用PBS代替一抗做阴性对照。

3.结果判断：采用CD34抗体标记血管内皮细胞，血管内皮细胞不着色者视为阴性，被染成棕黄色者为阳性，不计数肿瘤出血区及边缘反应区，以确保肿瘤MVD的准确性。凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群者均作为1个血管计数。计数者在临床病理资料均不知晓的情况下进行，先在低倍镜(×100)下全面观察切片，寻找高血管密度区，即热点区(hotspot)，再在高倍镜(×200)下计数5个视野内的微血管数目，取其平均值作为该切片MVD值。

LN的免疫组织化学染色情况以细胞浆及基底膜染色情况分级，10％以上的细胞着色，细胞浆或基底膜见淡黄色细颗粒，明显高于背景色为阳性；小于10％的细胞着色或细胞浆和基底膜着色与背景一致为阴性。根据阳性细胞占全部肿瘤细胞的比例将其分为4级：①阳性细胞<10％为(-)；②10％～25％记为(+)；③阳性细胞25％～50％为(++)；④阳性细胞>50％为(+++)。

三、统计学分析

应用SPSS13.0统计软件包，采用Spearman等级相关检验，单因素方差分析，X2检验和精确概率检验，检验效能设为0.05。

结果

一、LN的免疫组化结果

LN定位于血管的基底膜及细胞浆，本组病例在正常脑组织有37.5%的病例表达，表达部位在血管的基底膜，血管壁的厚度亦无差异，低度恶性胶质瘤组的表达率为64.7%，在恶性胶质瘤的表达要明显增强，表达阳性率为88.65%，除在血管基底膜有表达外，28%的胶质瘤可见到神经元或异形神经元细胞胞浆有染色，表现为染色增强，血管壁厚度增加，并随着肿瘤级别的增高出现血管基底膜分层的现象，两层或多层，特别是在血管内皮细胞增生明显处，有的还呈放射状向周围肿瘤细胞间延伸，其表达明显强于正常脑组织对照组，高度恶性组与低度恶性组和正常脑组织对照组之间差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.05)，前者显著高于后者。LN表达在不同性别、年龄、肿瘤部位的差异无统计学意义(P>0.05)，在不同肿瘤病理分级中的差异均有统计学意义(P<0.05)。

二、微血管密度(MVD)检测

CD34抗体的免疫染色部位在血管内皮和小血管壁，正常脑组织和脑胶质瘤组织中均有表达。但表达的强度和MVD的数量及分布不同，正常脑组织表达较弱，微血管数量亦少，而脑胶质瘤组织显示在肿瘤间质中清晰可见所有的毛细血管、小静脉和小动脉内皮细胞均为CD34阳性染色，管腔不规则，其血管生成具有异质性。

三、MVD与脑胶质瘤病理分级的关系

正常组与胶质瘤组比较，P<0.05，Ⅰ-Ⅱ级与Ⅲ-Ⅳ级两组比较P<0.05，Ⅲ、Ⅳ级两组比较P>0.05。

四、MVD与LN关系

经等级相关检验MVD和LN之间有相关关系(P<0.01)。

讨论

一、血管生长对脑胶质瘤细胞侵袭性的影响

肿瘤特别是恶性肿瘤，呈现出无限制的生长、增殖和侵袭的本性，表现为永生化的现象，恶性肿瘤细胞的基本特征是具有失去控制的增殖能力和浸润转移能力，而后者常常是癌症患者死亡的最重要最常见的原因之一。

Liotta等用移植鼠纤维肉瘤模型研究发现，癌灶中无血管球状体在体外只能生长到4mm，进一步生长和转移只有在球状体血管化后才发生。血管生成涉及到内皮细胞、基底膜以及胞外基质等之间的复杂作用。血管生成的快慢与组织增生的快慢有关。血管生成、肿瘤细胞增生以及移行是实体肿瘤(如胶质瘤)的重要特征[5,6]。Li等[7]使用绿色荧光抗体(greenfluorescenceprotein,GFP)标记的R3230Acor4T1细胞(20～50个细胞)种植到裸鼠背部皮肤下，结果显示，肿瘤细胞分裂至100个细胞左右便开始了血管生成的过程。肿瘤细胞在新生血管生成以前便趋向宿主血管运动，此现象提示宿主血管能够分泌一种或多种信号使肿瘤细胞产生趋向运动,这种信号可能包括乏氧、酸性环境、低糖血症、肿瘤不断生长而产生的压力、浸润的炎性细胞或肿瘤细胞引起的炎性反应、癌基因激活(分泌生长因子)、抑癌基因失活等,上述因素可触发血管生成的开关[8,9]。MVD与肿瘤侵袭和转移的关系在乳腺、胃肠道和膀胱等部位的恶性肿瘤中得到证实[10]。动物实验结果显示微血管生成是肿瘤转移所必需的,微血管的形成增加了肿瘤细胞进入微循环的机会,因此肿瘤内MVD可能与肿瘤的侵袭性行为和转移有关[11,12]。Weidner[13]等研究发现，肿瘤的增殖、转移和复发与肿瘤的平均微血管计数无相关性，而与高密度血管区（热点区）的微血管计数有良好的相关性。国外研究发现MVD与术后复发及患者生存期密切相关，可作为一项独立的预后指标[14]。本研究应用CD34抗体显示血管内皮细胞，发现CD34免疫组化染色仅见于血管内皮细胞膜，形成环状(横切面)或条状(纵切面)的棕色染色，正常脑组织及胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级中新生微血管数量少，而胶质瘤Ⅲ～Ⅳ微血管数量显著增加，血管丧失正常外形，扩张扭曲，管腔不规则。不同病理分级的胶质瘤中的MVD差异有显著性，恶性度愈高，MVD愈高。说明胶质瘤中MVD能较好反映病期进展，高水平的MVD预后不良，MVD可以作为胶质瘤预后和肿瘤诊断的指标之一，与国外的报道一致。本实验结果显示，MVD与胶质瘤的恶性程度关系密切，这可能与胶质瘤大量新生血管的形成促进了瘤细胞的恶性增殖及异形性改变有关。

二、LN对脑胶质瘤侵袭性的影响

在众多的ECM成分中，LN被认为在神经系统形态的形成中起了明显的作用，并能够促进细胞的迁移、识别及诱导神经轴突在体外生长[15]。星形胶质组织被认为是中枢神经系统神经细胞在体外生长的唯一基质[16]，是中枢神经系统中ECM分子的主要来源，并能产生LN。

正常胶质细胞生成的LN和外源性的LN都是神经元生长的首要的培养基。神经胶质细胞在体内、体外均被证实可以产生LN[17]。JaneFaria[18]等人的研究发现，人的神经胶质瘤细胞不管其恶性等级怎样，仍保持着像星形细胞一样支持神经突的形成，维持神经细胞生长、生存特性，但它不能识别新生神经细胞所产生的胚芽，不能像正常神经胶质细胞那样区分新老神经细胞。LN是神经突生长中ECM的组成部分，并在神经胶质细胞表达。这与我们的实验结果相符合，解释了LN在大多数情况下定位于肿瘤的血管基底膜，但在部分正常的及异形性的神经元细胞胞浆中也有表达。LN的神经调控可能与活体内神经胶质及肿瘤细胞的生物学作用相关。

三、LN与血管生长在脑胶质瘤侵袭过程中的协同作用

如前所述,LN是构成血管基底膜的一种重要的ECM成分,在肿瘤新生血管的形成过程中，血管基底膜的成分会发生改变，基因微结构排列分析同样证实LN基因表达的上调。移行的神经胶质瘤细胞在内皮细胞及星形胶质细胞之间发生迁移，在宿主大脑的脉管系统构成两种不同的基底膜。这些神经胶质瘤细胞取代了星形胶质细胞，与内皮细胞表面结合，说明内皮基底膜表达的LN是神经胶质瘤细胞延血管移行的促进者[19]。神经胶质瘤细胞象恶性黑色素瘤一样黏附在内皮细胞形成的血管管壁外表面，并顺其发生迁移，LN在这个过程中起了很大的作用[20]。B.B.Tysnes[21]等通过使用抑制性抗体遏制神经胶质瘤细胞侵入鼠脑组织的研究中发现该组织的脉管系统也是明显缺乏的。LN使神经胶质瘤细胞延脑血管发生迁移并扩展。而源自神经胶质瘤细胞的LN在肿瘤发生过程中又作用于肿瘤细胞自身及其它神经胶质瘤细胞和血管内皮细胞。我们的实验也证实了LN与MVD在胶质瘤的侵袭性中所起的作用有相关性，且均为正相关因素，说明LN与血管生成在胶质瘤的侵袭中是相互协同、相互促进的。

胶质瘤的血管生成和血管微结构的塑形对于肿瘤细胞获得充分的氧和养分起十分重要的作用。而且放疗、化疗、免疫治疗以及基因治疗的有效性很大程度地依赖于大分子或小分子的跨血管运动能力。数年以前，研究者便认识到了血管生成对肿瘤生长的重要性，其中内皮细胞增生和移行最为重要。在肿瘤治疗时,抑制血管生并阻断其血供可有效地抑制肿瘤的生长。由于传统的肿瘤细胞毒性治疗对于病人的生存期无明显改善,目前,血管生成的分子生物学机制的研究为延长胶质瘤病人的生存期带来了新的希望[22]，是目前肿瘤治疗中的焦点。我们通过实验探讨了LN和MVD与胶质瘤的侵袭性、恶性程度有关，且两者在这一过程中为正相关因素，为胶质瘤的抗血管生成治疗提供理论证据。

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