实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究

实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究

罗梦花

邵阳市疾病预防控制中心湖南邵阳422000

【摘要】[目的]：分析实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究。方法：采用实时荧光定量PCR法对增菌液进行检验，分离培养法根据GB4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》以及GB4789.4-2012《食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验》对标本进行检测。结果：采用实时荧光定量PCR方法对食品从业人员中的沙门菌和志贺菌的检出率为0.88%，采用分离培养法对食品从业人员中的沙门菌和志贺菌检出率为0.40%，PCR方法的检出率明显高于分离培养法，P〈0.05表示统计学有意义。结论：采用实时荧光定量PCR法对食品从业人员肠道中沙门菌以及志贺菌的检出率以及准确度较高，在检测实时性上比较有优势，因此，为食品从业人员进行PCR检测方法具有较高的意义。

【关键词】实时荧光定量PCR法；分离培养法；沙门菌；志贺菌

食品从业人员体内不能携带伤寒、痢疾等病原菌，不能取得相应的健康证明就不能从事相应的行业，但实际能够引发感染和腹泻的菌株为沙门菌和志贺菌，因此对食品从业人员肠道中两种菌株的检测显得十分重要。目前，我国大部分地区采用传统的分离培养方式进行检查，分离培养法检测时间长，对菌株检测的灵敏度较低，不能满足疾病预防控制中心公共卫生部门对食品从业人员体检要求[1]。实时荧光定量PCR法对两种菌株的检测具有较高准确度，但是在实际运用范围较窄。

1材料和方法

1.1标本来源选取本市疾病预防控制中心从业人员体检门诊肛拭子2015全年检测7000份样本。

1.2试剂试剂均在有效期内使用。

1.2.1沙门氏菌培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（BPW），四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液，亚硫酸铋（BS）琼脂，HE琼脂，木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，沙门氏菌属显色培养基，三糖铁（TSI）琼脂，由广东环凯微生物科技有限公司生产，API20E肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒由法国生物梅里埃公司生产，沙门氏诊断血清（60种）由宁波天润生物药业有限公司生产，沙门氏菌荧光定量检测PCR检测试剂盒由宁波天润生物药业有限公司生产。

1.2.2志贺氏菌培养基和试剂

志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素，麦康凯（MAC）琼脂，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂，志贺氏菌显色培养基，三糖铁（TSI）琼脂，厌氧包由广东环凯微生物科技有限公司生产，志贺氏诊断血清（60种）由宁波天润生物药业有限公司生产，志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒宁波天润生物药业有限公司生产。

1.3仪器ABI7500荧光定量PCR仪、生物安全柜以及高速冷冻离心机等。

1.4方法采用实时荧光定量PCR法对增菌液进行检验，分离培养法根据GB4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》以及GB4789.4-2012《食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验》进行检测[2]。

1.4.1采样方法采用肛拭子插入肛齿线中3厘米左右，轻轻旋转三周后取出。

1.4.2分离培养法

1.4.2.1沙门氏菌检验程序如下：采取肛拭接种于SC、TTB、36±1℃/42±1℃增菌18~24h，接种BS、XLD平板和MAC平板，36±1℃普通培养箱培养18~24h，挑取可疑菌落接种TSI，API20E试剂盒生化鉴定及血清分型。

1.4.2.2志贺氏菌检验程序如下：采取肛拭接种于志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素41.5±1℃增菌16~20h，接种XLD平板和MAC平板，36±1℃普通培养箱培养18~24h，挑取可疑菌落接种TSI，API20E试剂盒生化鉴定及血清分型。

1.4.3实时荧光定量PCR法

1.4.3.1沙门氏菌属（shlmonella.spp）荧光定量PCR检测：

1.取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10，000rpm离心5min，弃去上清；加入50ulDNA提取液，充分混匀后沸水浴5min，13，000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20℃以待检测。2．将PCR反应液置室温平衡，融化后取Taq酶，按2U/管加入Taq酶，即每个测试反应体系配制为：PCR反应液22.5ul+0.4ulTaq酶。3．加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13，000rpm离心5min。阴、阳性对照使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的模板或阴、阳性对照各2ul，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号。4．上机扩增、检测区：反应条件为95℃：3min，1个循环；95℃：5sec，60℃：40sec（信号采集），40个循环。反应体系设为25ul。对于多通道荧光PCR仪，信号采集时设定为Fam荧光素。

1.4.3.2志贺氏菌属（Shigella.spp）荧光定量PCR检测：

1．取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10，000rpm离心5min，弃去上清；加入50ulDNA提取液，充分混匀后沸水浴5min，13，000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20℃以待检测。2．将PCR反应液置室温平衡，融化后取Taq酶，按2U/管加入Taq酶，即每个测试反应体系配制为：PCR反应液22.5ul+0.4ulTaq酶。3．加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13，000rpm离心5min。阴、阳性对照使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的模板或阴、阳性对照各2ul，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号。4．上机扩增、检测区：反应条件为94℃：3min，1个循环；94℃：15sec，55℃：40sec（信号采集），72℃：15sec，40个循环。反应体系设为25ul。对罗氏（Roche）荧光PCR仪（不包括480型）反应条件中的变性温度设为92℃，其他条件不变。对于多通道荧光PCR仪，信号采集时设定为Fam荧光素。

1.5统计学方法计量资料采用t检验，采用%表示，计数资料采用X2检验，采用（x±s）表示，P〈0.05表示统计学有意义。

2结果

2.1两种方法检测率对比采用实时荧光定量PCR方法对食品从业人员中的沙门菌和志贺菌的检出率为0.88%，采用分离培养法对食品从业人员中的沙门菌和志贺菌检出率为0.40%，PCR方法的检出率明显搞对分离培养法，P〈0.05表示统计学有意义。见表1。

〈0.05

2.2PCR真实性指标评价检测灵敏度的指标能够反应检测方法对阳性样品的符合情况，特异度的指标能够反应检测方法对阴性样品的符合情况。假阴性率反映了筛查过程中漏查的情况，假阳性率反应的试剂就是阴性率[3]。研究发现，沙门菌的灵敏度为100%。特异度为99.7%。假阴性率为0，假阳性率为0.187%。志贺菌灵敏度也为100%，特异度为99.9%，假阴性率为0，假阳性率为0.00997%。

3讨论

目前，我国大部分地区采用传统的分离培养方式进行检查，分离培养法检测时间长，对菌株检测的灵敏度较低，不能满足疾病预防控制中心公共卫生部门对食品从业人员体检要求。

研究发现，采用PCR方法对食品从业人员中的沙门菌和志贺菌的检出率为0.88%，采用分离培养法对食品从业人员中的沙门菌和志贺菌检出率为0.40%，PCR方法的检出率明显高于分离培养法，P〈0.05表示统计学有意义。沙门菌的灵敏度为100%。特异度为99.7%。假阴性率为0，假阳性率为0.187%。志贺菌灵敏度也为100%，特异度为99.9%，假阴性率为0，假阳性率为0.00997%。

总而言之，采用实时荧光定量PCR法对食品从业人员肠道中沙门菌以及志贺菌的检出率以及准确度较高，在检测实时性上比较有优势。

参考文献：

[1]韩毅，孙燕萍，周虹等.实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究[J].中国食品卫生杂志，2015，27（2）：132-135.

[2]江晓，叶艳华，王炜等.实时荧光PCR法快速分离食源性致病菌[J].预防医学情报杂志，2012，28（4）：317-319.

[3]吴晓芳，韩建康，纪蕾等.多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌[J].疾病监测，2011，26（3）：234-237.