无创产前DNA检测技术在高龄孕妇染色体异常检测中的应用

无创产前DNA检测技术在高龄孕妇染色体异常检测中的应用

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扬州大学医学院附属淮安市妇幼保健院淮安市医学遗传与产前筛查科223002

基金项目：江苏省妇幼健康科研项目（F201670）

通讯作者：潘琼Email:jonespan@163.com

摘要：目的研究无创产前DNA检测(Non-invasivePrenatalTesting,NIPT)技术在高龄孕妇中的应用价值。方法选取2015年11月1日至2016年6月31日在我院进行NIPT的高龄单胎孕妇，以BES4000新一代高通量测序仪进行检测，对于高风险结果建议行侵入性产前诊断或/和AffymetrixCytoScan750KArray基因芯片检测，统计分析NIPT检测的准确性。结果共收集高龄孕妇791名，NIPT检测发现高风险20例(2.5%)。其中T21高风险6例，确诊3例，假阳性1例，拒绝羊穿2例；T18高风险2例，确诊1例，拒绝羊穿1例；T13高风险1例，拒绝羊穿1例。性染色体异常5例，确诊4例，假阳性1例。其他染色体异常6例。结论NIPT检测对于高龄孕妇具有临床可行性，有较好的应用前景。

关键词：高龄，无创产前DNA检测，染色体异常，胎儿游离DNA

随着国家二孩政策的全面实施，高龄孕妇所占妊娠比重也在随之增加。随着年龄的升高，胎儿染色体三体发生率也随之增加[1]，因此对于预防高龄孕妇生产染色体异常胎儿的责任也越来越重。在产前应用较多的异常染色体筛查/诊断技术包括血清学筛查，无创产前DNA检测(Non-invasivePrenatalTesting,NIPT)和羊水核型分析等。现对NIPT技术在高龄孕妇异常染色体检测中的应用探讨如下。

1.材料与方法

1.1研究对象选择2015年11月1日至2016年6月31日在我院进行无创产前DNA检测的高龄孕妇791名，年龄35至47岁，孕周16周至27+5周，单胎，无异常染色体胎儿分娩史。受检者拒绝有创性产前诊断并自愿接受无创产前DNA检测。

1.2方法

1.2.1样本采集及处理采用EDTA抗凝管收集5mL孕妇外周血，4℃，1600g离心吸取上层血浆，然后4℃，16000g离心去除残余细胞，每管600微升保存3管血浆，放置-80℃冰箱保存。

1.2.2DNA提取、文库制备和测序天根公司柱式提取法试剂盒提取血浆DNA，采用晶芯?染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（半导体测序法）制备文库，使用BES4000新一代高通量测序仪进行测序。

1.2.3阳性结果验证对于检测结果为染色体非整倍体异常及拷贝数异常的孕妇，经知情同意之后行羊水穿刺术，取羊水细胞进行染色体核型分析或者基因芯片。300-400条带常规G显带染色体核型分析，仅适用于10Mb以上片段的检测。基因芯片为AffymetrixCytoScan750KArray芯片，包含有200,000SNP标记和550,000CNV标记，以平均大约1个标记/4kb的密度分布于人类的整个基因组。[1]

2.结果

本院接受NIPT孕妇2888名，其中有高龄孕妇791名（27.4%）；共检测到存在异常染色体数的孕妇有52名，其中高龄孕妇20名（38.5%），阳性率20/791（2.5%）。该20名染色体异常孕妇，其中T21高风险6例，确诊3例，假阳性1例，拒绝羊穿2例；T18高风险2例，确诊1例，拒绝羊穿1例；T13高风险1例，拒绝羊穿1例。性染色体异常5例，确诊4例，假阳性1例。其他染色体异常（包括微缺失/微重复/其他染色体三体高风险）6例，确诊1例，假阳性5例。有5例拒绝羊膜腔穿刺术进行侵入性产前诊断（25%）。

3.结论

染色体病是染色体数目异常或结构异常引起的疾病，是出生缺陷的主要病因之一[2]。随着孕妇年龄的增加，染色体异常胎儿出生几率也在增加，在本院2015年11月至2016年6月之间，检测到染色体异常的孕妇中，高龄孕妇占38.5%，这一比例也说明对于高龄孕妇来说，产前筛查和产前诊断的重要性和必要性。

NIPT技术利用新一代测序技术，对孕妇外周血中存在的胎儿游离DNA进行检测，通过生物信息学统计分析发现胎儿染色体是否存在21、18、13号染色体三体，与血清学筛查相比，其准确性和特异性较高[3]。但该方法仍属于筛查，仍需要对阳性结果进行产前诊断进行确诊。本研究中一例经确诊发现为T21假阳性的孕妇，其NIPT检测结果为21号染色体Z值3.124，重抽血再次进行检测发现Z值仍在灰区，遂发出高风险报告建议孕妇进行羊膜腔穿刺予以确诊。本研究中发现7号染色体异常数目较多，可能存在实验偏好性，导致软件对于7号染色体假阳性较高。一例NIPT发现为20号染色体三体高风险的孕妇，经羊水核型分析发现为46,XN/47,XN,+20[85/5]，T20低比例嵌合，说明NIPT技术灵敏性较高。

随着二孩政策的实施，未来几年儿童数量会显著增加，对于出生缺陷儿的防控也是重中之重。虽然NIPT高风险结果仍需其他产前诊断技术进行确诊，但它在孕妇产检过程中减少了孕妇对羊膜腔穿刺术的恐惧，而且NIPT取代血清学筛查是趋势，对于产前筛查来说NIPT是一种重要的技术补充手段，随着测序成本的降低，在高龄孕妇中普及NIPT将成为可能。

参考文献：

[1]邹波,张莉超,施丹华.孕妇年龄风险与胎儿染色体异常的相关性分析[J].中华医学遗传学杂志,2015(1).

[2]张丽芳，许平，范佳鸣等.孕妇年龄风险与胎儿染色体异常的相关性分析.浙江省医学遗传学学术年会暨高通量基因测序产前筛查与诊断技术研讨会.2015

[3]蔡婵慧，郭莉，胡晶晶等.4636例高龄孕妇羊水细胞染色体分析.中国优生与遗传杂志,2014(8)