PTEN基因及其相关因子HIF-1α在急性髓性白血病骨髓基质细胞中的表达及意义

PTEN基因及其相关因子HIF-1α在急性髓性白血病骨髓基质细胞中的表达及意义

武寿荣

武寿荣（江苏省滨海县人民医院江苏滨海224500）

【中图分类号】R733.3【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）16-0010-02

【摘要】目的探讨PTEN基因及其相关因子HIF-1α在急性髓性白血病(AML)骨髓基质细胞中的表达及意义。方法取30例急性髓性白血病患者（AML组）和30例非AML患者（对照组）骨髓基质细胞分离纯化后培养，以RT-PCR检测其中PTENmRNA的表达，并通过凝胶图像分析系统分析其相对含量。同时以Western免疫印迹技术检测骨髓基质细胞中PTEN和HIF-1α蛋白表达。结果急性髓性白血病患者骨髓基质细胞中PTEN基因和蛋白的表达率及相对含量均显著低于对照组(P<0.01，P<0.05)，HIF-1α蛋白表达率及表达水平显著高于对照组(P<0.01，P<0.05)。HIF-1α在骨髓基质细胞中的表达上调与PTEN的低表达相关联(P<0.05)。结论PTEN基因可能是抑制白血病异常骨髓造血形成的重要因子，而PTEN表达缺失或下调可能诱导其下游因子HIF-1α的高表达。

【关键词】急性髓性白血病PTEN缺氧诱导因子-1α骨髓基质细胞

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetherelationshipamongexpressionofPTENgeneandHIF-1αinpatientswithacutemyeloidleukemia(AML).MethodsBonemarrowstromalcells(BMSCs)from30AMLpatientsand30non-AMLcontrolswerecultivated.TheexpressionofPTENmRNAweredetectedbyRT-PCRandtherelativeamountswereanalyzedwithgelscansystem.Simultaneously,theexpressionofPTENandHIF-1αproteinsinBMSCsweremeasuredbyWesternblotting.ResultsTheexpressionrateandlevelsofPTENmRNAandproteininAMLgroupwerealllowerthanthatincontrolgroup(P<0.01，P<0.05).Bycontraries,thepositiveexpressionrateofHIF-1αproteininAMLgroupwashigherthanthatincontrolsobviously(P<0.01,P<0.05)andtheexpressionlevelsweresignificantstronger(P<0.05).TherewerecertainnegativecorrelationbetweenPTENandHIF-1αinallBMSCs.ConclusionsPTENgenewouldinhibitedtheformationoftheabnormalhematopoieticmicroenviroment.Thelossordown-regulationofPTENgenewouldleadtheover-expressionofHIF-1αinAML.

【Keywords】AMLPTENHIF-1αBonemarrowstromalcell

PTEN基因又名MMAC1或TEP1基因，是一种目前公认的肿瘤抑制基因，与恶性肿瘤的生长、细胞分化、增殖、凋亡等许多病理过程密切相关[1]。研究表明，PTEN基因对造血干细胞的活化和分化起重要的调控作用，对白血病的发生有重要的抑制作用[2]。而PTEN基因的缺失或突变可以影响下游诸多肿瘤相关因子的表达，其中包括缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）。HIF-1α是广泛存在于人体内的一种转录因子，其在肿瘤基质和肿瘤缺氧微环境的形成中发挥重要的作用，对恶性肿瘤的生长、转移等皆有影响[3]。目前已知HIF-1α在肿瘤中的表达可能与PTEN基因有关，但其确切机制尚未阐明。本研究采用RT-PCR技术检测了急性髓性白血病患者骨髓基质细胞中的PTEN基因，并用Western免疫印迹技术分析了PTEN及HIF-1α蛋白的表达情况，以分析两者在白血病异常骨髓基质细胞形成中的作用和相互关系。

1材料与方法

1.1标本来源收集附院2008-2010年初治成人急性髓性白血病患者骨髓30例，另收集同期非血液系统恶性疾病患者或查体患者骨髓30例设为对照组，经均衡性检验，两组年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05）。所有标本均经病理组织学证实，患者均签署知情同意书。

1.2骨髓基质细胞分离培养注射器肝素化后抽取3～5ml骨髓，将所获得的骨髓100目钢网过滤后，平头吸管反复抽吸吹打制成单细胞悬液，采用全骨髓培养法以1×106/ml置于50ml培养瓶中培养，每瓶含10ml培养液置于37℃、5%CO2湿化空气的孵箱中进行原代培养。48h后半量换液，以后每48～72h全量换液。细胞汇合度达80%左右时提取总蛋白和总RNA。

1.3总RNΑ提取贴壁骨髓基质细胞用PBS洗涤后，采用Trizol法提取总RNΑ，在260nm处测定总RNΑ浓度及纯度。使用MMLV第一链cDNΑ合成试剂盒逆转录cDNΑ第一链，接着合成第二链。将所得产物冻存于－20℃以备PCR扩增。

1.4PTEN基因扩增PTEN引物参照GenebαnkPTEN基因(ID:NM_000314)序列设计，上游5'－GΑTGGCΑCTTTCCCGTTTTΑ－3'，下游引物5'－TCTGΑGCΑTTCCCTCCΑTTC－3'，扩增产物大小254bp；内参对照为GΑPDH，引物序列为：上游5'－CTGΑCCTGCCGTCTΑGΑΑΑ－3'，下游5'－GGGGΑGΑTTCΑGTGTGGTG－3'，扩增产物大小380bp，引物的使用浓度均为50pmol/μL。PCR反应体系50.0μL，包括10×Buffer5.0μL，25mmoldNTPmixture0.5，TαqDNΑ酶1.0μL，PTEN引物上下游各1.0μL，GAPDH引物上下游各1.0μL，cDNΑ模板1.0μL，无菌水38.5μL。反应条件：95℃预变性3分钟后，以95℃变性30秒，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；再72℃延伸10分钟后终止反应。PCR产物于2%的琼脂糖凝胶做电泳，以DEPC水代替cDNΑ模板为阴性对照，四星凝胶成像系统进行半定量分析，相对表达量以同一反应体系中PTEN产物积分指数与GΑPDH条带积分指数的比值来表示。

1.5Western-blot检测PTEN、HIF1α蛋白的表达提取骨髓基质细胞总蛋白进行含量检测，常规法进行Western-blot检测。兔抗人PTEN、兔抗人HIF1α抗体、βactin抗体及二抗均1∶1000，ECL显影后在BIO-RADXDS+图像分析系统上扫描计算灰度积分。

1.6统计方法所有数据采用SPSS11.0软件处理，数据以x±s表示，两组均数的比较采用t检验或t’检验，两组率的比较用χ2检验，P<0.05认为差异有统计学意义；两种指标间相互关联分析应用χ2检验，P<0.05认为两种因子表达存在关联。

2结果

2.1骨髓基质细胞培养骨髓基质细胞培养4～5天后，镜下可见贴壁细胞开始增殖并向三角形、多角形、梭形等分化，表面颗粒少。6～8天后，部分区域形成细胞团簇，细胞呈现成纤维细胞梭形外观，有较多突起，胞核明显，呈卵圆形，可见1～3个核仁，胞质丰富、清晰。

2.2PTEN基因PCR扩增30例AML组和30例对照组患者骨髓基质细胞总RNΑ提取后进行RT－PCR扩增，得到位于254bp处PTEN基因扩增条带及380bp处GΑPDH内参基因条带。AML组中PTEN阳性检出率为46.67%，对照组为100%，两者有显著性差异。以四星凝胶分析系统计算PTEN基因的相对表达量，AML组中有14例表达PTEN基因，相对表达量均值为0.244±0.162；30例对照组骨髓基质细胞均表达PTEN基因，相对表达量均值为0.928±0.304，两组差异有统计学意义。

2.3PTEN及HIF-1αWestern免疫印迹检测Western结果显示PTEN蛋白AML组表达率为46.67%，对照组为100％，两者存在显著差异，蛋白表达率与基因扩增阳性率相一致。HIF-1α蛋白AML组表达率为96.67%，对照组为66.67％，两者存在显著差异。对免疫印迹条带进行灰度扫描，发现两种蛋白表达程度在两组间也存在明显差异。AML组PTEN蛋白平均灰度积分为3.442±1.029，对照组中PTEN表达明显更强为5.093±2.192，两者存在显著性差异(t’＝3.73，P<0.05)；与此相反，AML组HIF-1α蛋白表达灰度积分为6.143±3.240；明显高于对照组的1.865±0.771((t’＝7.04，P<0.05)。

2.4PTEN和HIF1α表达的相关性分析Western结果显示PTEN表达阳性44例中HIF-1α表达阳性为33例，PTEN表达阴性样本16例中HIF-1α表达阳性为16例，检验得χ2=4.90，P=0.027，r=-0.286，提示PTEN和HIF-1α表达存在负性关联。

3讨论

已有的研究证实PTEN可通过促进细胞凋亡和抑制肿瘤细胞浸润等多种途径发挥抗癌作用，其缺失、突变与人类许多恶性肿瘤有关，但由于其作用机制在不同肿瘤中不尽相同，因而目前对其认识尚不十分明了。本研究采用RT-PCR法检测30例急性髓性白血病患者和30例对照样本骨髓基质细胞中PTEN基因mRNΑ表达，结果表明PTEN基因作为一种抑癌基因，在AML患者骨髓基质细胞中的表达呈显著下调甚至缺失，与对照组相比存在明显的统计学差异，提示PTEN基因缺失或下调可能与AML的发生发展过程密切相关。由于RT-PCR仅检测经转录加工后的mRNΑ，而疾病的发生往往与特异蛋白质的变化更加密切相关，因而检测表达于细胞浆中的PTEN蛋白可能更具临床意义。本研究以Western免疫印迹法对骨髓基质细胞中的PTEN蛋白进行了定量分析，结果表明PTEN蛋白表达与基因表达相一致，表现为AML组患者PTEN蛋白表达与对照组相比，不仅表达率明显下调，且表达的强度也显著下降，两种差异均有统计学意义。这从蛋白水平印证了PTEN的下调或缺失在AML患者中普遍存在，与AML的发生发展有密切联系。

综上所述，PTEN基因及其相关因子HIF-1α的表达与急性髓性白血病的发生发展、与AML异常骨髓造血微环境的改变等密切相关，对PTEN/P13K/AKT/FRAP/HIF-1α这一调控链的深入研究，将对急性髓性白血病的临床诊断、基因治疗、预后判断等各个方面产生重要的积极作用。

参考文献

[1]LiJ,YenC,LiawD,etal.PTEN,aputativeproteintyrosinephosphatasegenemutatedinhumanbrain,breast,andprostatecancer.Science.1997;275(5308):1876-8.[PMID:9072974].

[2]CellaiC,LaurenzanaA,BianchiE,etal.MechanisticinsightintoWEB-2170-inducedapoptosisinhumanacutemyelogenousleukemiacells:thecrucialroleofPTEN.ExpHematol.2009;37(10):1176-1185.[PMID:19615424].

[3]SemenzaGL.Expressionofhypoxia-induciblefactor1:mechanismsandconsequences.BiochemPharmacol,2000;59(1):47-53.[PMID:10605934].