微生物检测有效性的保证要点微探

微生物检测有效性的保证要点微探

崔志文

浙江双良商达环保有限公司浙江杭州310000

摘要：虽然我国地大物博,海洋湖泊占地颇多,但是淡水资源并不充裕。再加上我国人口基数庞大,人均淡水资源只有世界平均水平的1/4,在世界上名列110位,是全球人均水资源最贫乏的国家之一,大多数的城市都存在着水资源不足的情况,甚至由于淡水分布不均,造成局部地区严重缺水。当然,出现这种情况的不只我们国家,世界各地都有水资源缺乏的现象存在。而且,随着现代化工农业的飞速发展,各地污水的排放都严重加剧了水污染,我们只有加强水质的检测,严密分析检测结果,科学处理水质的污染,才能更好地实现水资源的循环利用。准确的检测结果是做出合理应对措施的前提,所以,现在要研究的课题,就是如何提高水质检测结果的准确度。

关键词：微生物检测；有效性；要点

1材料与方法

1.1菌株、样品、仪器与培养基

菌种为大肠埃希氏菌(ATCC25922,广州环凯生物科技有限公司)。样品为冻干粉末(中国检验检疫科学研究院测试评价中心)。EZ-fit3微生物过滤系统(德国默克密理博公司);ZF-2暗箱式三用紫外分析仪(上海光豪分析仪器有限公司);SW-CJ-2FD超净工作台(广州瑞智净化设备有限公司);YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);HH.S21-8电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);SPX-150B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);L3201LED4荧光显微镜(广州粤显光学仪器有限责任公司)。

主要培养基为肉汤培养基、品红亚硫酸钠培养基、乳糖蛋白胨培养液、MFC培养基、EC培养基、MUG营养琼脂培养基、革兰氏染色液(广东环凯微生物科技有限公司);培养基配制用水为超纯水。

1.2方法

1.2.1阳性菌液的制备

将大肠埃希氏菌(ATCC25922)从磁珠保存管中接出,置于灭菌肉汤中,37℃培养24h。对照麦氏比浊管,使用灭菌生理盐水制备约100CFU/100mL的菌悬液,即为阳性菌液。

1.2.2待测水样的制备

按照能力验证参试指导书的方法处理2份冻干样品,无菌操作,使用灭菌生理盐水对冻干粉再水化,充分溶解、混匀,得到220mL待测水样。

1.2.3试验方法

按照GB4789.1-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》及GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法微生物指标》(以下简称GB/T5750.12-2016)的要求开展检测。阳性菌液分别过滤50、20、10、1mL菌液,不够100mL的使用灭菌生理盐水补齐,并按照2.2.4的方法进行培养、验证、计数。

对照组则按照优化方法:使用生理盐水将阳性菌液稀释一倍,混匀,得到对照菌液。过滤对照菌液100、40、20、2mL,并在过滤2mL菌液前,往滤杯中加入10mL灭菌生理盐水。倒入菌液后沿滤杯壁旋转加入生理盐水补齐100mL,立即过滤。按照2.2.4的方法进行培养、验证、计数。

1.2.5能力验证待测水样的测定

能力验证待测水样根据以上试验得出的最优方法进行稀释、过滤。由于待测水样量有限,总大肠菌群和大肠埃希氏菌检验操作由2名实验人员独立操作,耐热大肠菌群由一名实验人员独立操作。

总大肠菌群测定。过滤菌液后的滤膜夹取,滤膜截留细菌面朝上,紧贴在品红亚硫酸钠培养基上,平皿倒置于恒温培养箱内37℃培养24h。挑取特征菌落进行革兰氏染色,再接种乳糖蛋白胨培养液,于37℃培养24h,有产酸产气为阳性,并计算结果。

耐热大肠菌群。过滤菌液后的滤膜夹取,滤膜截留细菌面朝上,紧贴在MFC培养基上,用防水胶带封贴每个平皿,并放入塑料袋内,浸到44.5℃恒温水浴里,培养24h。对可疑菌落转种EC培养基,44.5℃培养24h,如产气为阳性,并计算结果。

大肠埃希氏菌。培养的有典型菌落生长的滤膜,细菌截留面朝上转移到NA-MUG平板上,于36℃培养4h。培养后将平板在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外光灯照射,有荧光产生为阳性,计算结果。

2分析

根据过滤系统的使用说明,滤膜计数的最佳菌落数为小于50CFU/片,因此本实验选取阳性菌量小于50CFU的水样进行。本实验先使用未经稀释的阳性菌液和经稀释的对照阳性菌液进行对比试验。对照阳性菌液为阳性菌液先经1倍稀释,并且在过滤水样量较少的情况下(2mL)在滤杯内先倒入一定量无菌生理盐水,再加水样,再补齐100mL,防止菌落聚集。经过对比试验,发现阳性菌液滤膜上菌落生长分散性较差,特别是滤杯边缘滤膜上的菌落有聚集成片现象;稀释梯度菌落数比例不明显。对照阳性菌液菌落生长分散性较好,易于观察菌落特征和挑取,在低稀释度时可测出含菌量;同时旋转加入稀释液,一定程度上避免了滤杯边缘滤膜菌落聚集的现象。因此,选用对照菌液的处理及过滤方法,测定能力验证待测水样,结果比较满意,证实方法可行。

3加强水质微生物检验工作的质量控制策略

3.1加强对相关仪器设备的管理

仪器设备能否正常工作,直接关系到实验能否正常进行以及检测的结果是否准确。加强对仪器设备的管理是水质微生物检验工作质量控制的关键。不仅仅是使用前需要对仪器设备进行检定,在使用期间,也应该根据相关部门的规定定期对设备进行维护和检修,并且为使设备能够达到标准要求,满足检测标准和技术规范,要在两次检定期间切实做好核查的工作。

3.2加强操作流程管理与控制

有了好的设备,没有规范的操作流程也是无法将水质微生物检验工作很好的进行下去的。检验过程的各个环节都应该进行严格规定并且将强控制和监督,确保检验顺利进行。比如,要防止有害病菌进入净化室、培养室和无菌实验室,工作人员在进行检验工作时也要佩戴隔离衣帽,并且严格按照相关规定执行。定期用紫外线消毒无菌实验室,确保检验结果的准确。

3.3提升检验人员的整体素质水平

好的设备和规范的流程都是为人服务的,如果没有人员的参与,这些准备都将毫无意义,同样的,如果检验人员没有使用这些设备的能力或者其没有完成检验的责任心,检验也不会得出准确的结果。(1)应该加强对水质微生物检验人员的培训,包括理论知识、专业技能、设备使用方法甚至检测的注意事项等,使其理论知识和操作技能等专业素质都能得到大幅度提升。(2)加强对检测人员责任心以及职业道德观的培养,使其能够在工作中实事求是、认真负责,从而确保检验工作能够得到准确的结果。

结论

本论文提出了一种生活饮用水中总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌滤膜法处理优化的方法,并通过参加能力验证证实该方法有效。虽然证实方法可行,但本实验仍有些不足:受限于使用的过滤系统滤杯的定量,未能实现成比例的梯度取样;由于能力验证提供样品有限,未能实现更为合适的梯度取样,结果|z|偏大。因此在实际运用时,要根据待测水样的来源,对稀释倍数进行初判,再运用本论文优化的方法,以提高检验结果的准确性,从而提高实验室的检验检测能力。

参考文献

[1]彭佳艳,赵永,郑维斌,等.2014~2016年保山市农村饮用水卫生状况监测分析[J].食品安全质量检测学报,2018,9(15):4175-4179.

[2]王舒,李继芳,崔仲明.2017年辽宁省农村饮用水中微生物污染状况调查[J].中国卫生工程学,2018,(6):255-256.