隐色素Cry1过表达缓解异丙基肾上腺素对肿瘤细胞的增殖抑制作用

隐色素Cry1过表达缓解异丙基肾上腺素对肿瘤细胞的增殖抑制作用

徐蕾1（通讯作者）黄钱武1黄超1方凯1刘晓平

（1皖南医学院基础医学院生物化学教研室芜湖241002；2皖南医学院药学院安徽芜湖241002）

摘要：目的探讨生物钟蛋白隐色素Cry1和异丙基肾上腺素（ISO）对肿瘤细胞增殖的影响。方法培养胃癌HGC-27细胞，转染Cry1过表达质粒（实验组）或空载质粒（对照组），然后加入不同剂量（0~1000mM）的异丙基肾上腺素，采用CCK8法检测细胞存活率。结果对照组中细胞存活率随ISO的剂量的增加而明显下降，IC50约为166mM。转染不同质量Cry1过表达质粒的实验组IC50显著上升（0.3μgCry1，IC50=470mM；0.5μgCry1，IC50=532mM；1μgCry1，IC50=538mM）。结论隐色素Cry1过表达可以缓解异丙基肾上腺素对肿瘤细胞的增殖抑制作用，提示其对于肿瘤发展具有一定的促进作用。

关键词：隐色素；异丙基肾上腺素；肿瘤细胞；增殖抑制

隐色素（cryptochrome，Cry）是一类生物钟蛋白，可以参与生物体昼夜节律的调控[1]。人体中存在两种隐色素基因cry1和cry2，分别编码隐色素Cry1和Cry2蛋白。这两种隐色素蛋白可与另一类生物钟蛋白——周期蛋白（period，Per）相互作用，形成二聚体进入细胞核，抑制生物钟转录因子Clock和Bmal1对生物钟基因（包括cry1，cry2以及per基因在内）的转录激活作用，从而构成人体生物钟基因的负反馈回路，形成以24小时为周期的昼夜节律[2]。此外还有研究表明，Cry1蛋白可通过与腺苷酸环化酶（adenylylcyclase，AC）或者与激活型G蛋白（StimulatingtypeGprotein，Gs）相互作用，抑制第二信使cAMP的生成，从而抑制cAMP-PKA通路[3，4]。而cAMP-PKA通路可通过抑制Ras蛋白介导的MAPK信号通路，抑制细胞的生长和增殖[5-8]。cAMP-PKA通路的下调可能是肿瘤发生发展的重要因素。

目前已有研究表明，隐色素Cry1的表达与部分肿瘤的发生发展具有一定的相关性。例如，对慢性淋巴细胞白血病（chroniclymphocyticleukemia，CLL）的临床研究显示，Cry1高表达的患者较低表达的患者无进展生存期显著缩短，提示Cry1可以作为慢性淋巴细胞白血病疾病进展和预后标志[9]。对于结直肠癌的研究也表明，肿瘤组织中Cry1多为高表达，其表达水平与淋巴结转移和肿瘤TNM分期具有显著相关性；临床随访发现Cry1高表达与结直肠癌患者无病生存期和总生存期减少相关[10]。因此，研究隐色素Cry1的表达对肿瘤细胞增殖的影响具有重要的意义。

本研究选取胃癌HGC-27细胞作为研究对象，通过转染过表达质粒对Cry1进行过表达，加入cAMP-PKA通路的激动剂异丙基肾上腺素（isoprenaline，ISO），检测细胞存活变化。通过与转染空载质粒的对照组比较，研究了Cry1和ISO对肿瘤细胞增殖的影响。

1.材料与方法

1.1细胞培养

人胃腺癌细胞HGC-27为本实验室保存。培养基为1640+10%FBS+1%NEAA，同时加入1%的青链双抗。37℃，5%CO2的培养箱中培养，定期传代。

1.2质粒构建

提取细胞总RNA，使用随机引物进行逆转录，获得cDNA作为模板，采用引物hCryF（5`-AATGAATTCTGGGGGTGAACGCCGTGC-3`）和hCryR（5`-ACTGCGGCCGCCTAATTAGTGCTCTGTCTCTGGACT-3`）进行PCR扩增，使用BamHI和XhoI酶切，与相同酶酶切的pCMV-N-Flag质粒连接，获得过表达质粒pCry-N-Flag。经测序表明质粒测序成功。

1.3质粒转染及加药

用无血清培养基与Lipofectamine3000（ThermoFisherScientific）混合，涡旋震荡2～3s。在血清培养基中加入适量pCry-N-Flag或pCMV-N-Flag质粒，然后添加P3000试剂，温和混匀。将稀释好的转染试剂与稀释好的质粒混合，室温孵育5min。将上述复合物加入含有细胞和完全培养基的培养板中，培养24h后，然后加入不同浓度（0~1000mM）的ISO溶液，继续培养24h后检测。

1.4CCK-8试剂盒检测细胞增殖的变化

每孔加入10μlCCK-8试剂，然后在培养箱中继续孵育1~2h，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度。每个样品设三个复孔。

1.5统计学处理

采用SPSS20.0统计软件进行数据处理，多组之间数据采用单因素方差检验分析，两组间数据采用t检验分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2.实验结果

2.1ISO对肿瘤细胞增殖的影响

ISO是肾上腺素β受体的激动剂。在β受体激活后，活化Gs蛋白，Gs蛋白再激活AC，产生cAMP，cAMP作用于PKA，从而活化整个cAMP-PKA通路。PKA可通过磷酸化Ras蛋白，抑制MAPK信号通路[6]，因此cAMP-PKA通路激活后可能抑制细胞增殖。实验结果基本与预期相符，随着ISO浓度增加，HGC-27细胞的存活率明显下降。通过拟合计算可得，ISO对HGC-27细胞增殖抑制作用的IC50约为166mM（图1）。

图2隐色素Cry1对异丙基肾上腺素增殖抑制作用的影响

3.讨论

目前研究已表明，隐色素Cry1是人生物钟的核心组件之一，在调控生物钟方面起到重要的作用[1，2]。此外，Cry1还可能作为cAMP-PKA通路的抑制蛋白，在炎症、肿瘤、代谢调控等多方面发挥作用[3，4，11，12]。隐色素的表达紊乱可能与多种疾病，甚至肿瘤相关。多种肿瘤中Cry1均表现为高表达，且Cry1表达量的高低与预后成反相关关系[9，10]。

本研究结果表明，在没有外界因素胁迫的情况下，在肿瘤细胞中单独过表达Cry1对细胞存活率影响不大。但如果在存在cAMP-PKA通路激动剂异丙基肾上腺素的情况下，Cry1的过表达可以缓解其造成的增殖抑制作用。这表明，Cry1过表达可能对于肿瘤细胞在cAMP-PKA通路激动剂的胁迫下具有保护性的作用。这种作用可能是Cry1通过与cAMP-PKA通路中的蛋白（如AC或Gs蛋白）相互作用，进而抑制cAMP产生达到的。在后续研究中，我们将着力阐明与Cry1作用的具体蛋白种类、相互作用的机制。这些研究结果将有助于我们进一步认识隐色素在肿瘤发生发展中的重要作用。

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基金项目：国家自然科学基金（81272485）；安徽省高校优秀青年人才支持计划（2014年）；安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目（KJ2016A731）。