大蒜素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的影响及机制

大蒜素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的影响及机制

张玉碧1吕林华2吕立华3*

张玉碧1吕林华2吕立华3*

（1邵阳市中心医院血液肿瘤科湖南邵阳422000)

(2中山大学附一院广东广州510080；3邵阳医学高等专科学校药学系湖南邵阳422000）

【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）47-0231-02

【摘要】目的探讨大蒜素对体外培养的人肝癌HepG2细胞凋亡的促进作用及其分子机理。方法采用TUNEL法检测大蒜素对HepG2细胞凋亡的影响，提取Bcl-2基因的mRNA，以RT-PCR方法研究大蒜素对Bcl-2基因表达的影响。结果大蒜素使人HepG2细胞凋亡指数增加(P<0.01)，且呈剂量依赖效应；Bc1-2基因mRNA水平随大蒜素浓度升高而降低。结论大蒜素可促进人HepG2细胞的凋亡过程，并使Bcl-2基因mRNA水平降低，从而起到抗肿瘤的治疗作用.探讨大蒜素体内外诱导人肝癌细胞HepG2细胞凋亡的作用及机制。

【关键词】大蒜素肝癌HepG2细胞细胞凋亡Bcl-2mRNA

TheEffectofAllicinonAPoPtosisofHumanLiverCancerCellHePG2inVitroandItSMeChanism

【Abstract】ObjectiveToinvestigatethePromtionofAllicinonAPoPtosisofHumanLiverCancerCellLineHePG2inVitroandItSMeChanism.MethodsTodetecttheeffectontheapoptosisbyTUNELmethod,toobservetheeffectontheBcl-2geneRNlevelbyRT-PCRmethod.ResultsAllicinmadeindexinereaseinadose-dependentmanner(P<O.01).ThelevelofmRNAofBcl-2geneinereasedastheconcentrationofAllicindecreased.ConelusionAllicincanfacilitatetheapoptosisofHepG2cellandmakethelevelofMrnaofBcl-2decreased.

【Keywords】AllicinLivercancercellApoptosis

大蒜素是从大蒜球茎中提取的含硫化合物，具有强大的抗炎作用[1]，近年研究发现大蒜素具有防癌、抗癌的特点[2]。本文通过研究体外诱导人肝癌细胞HepG2细胞凋亡的作用的影响，以及检测大蒜素对Bd-2因表达水平的影响，研究其抗肿瘤的机理，为更好地发大蒜素的临床应用价值提供理论与实验依据。

1材料

HepG2细胞株；DMEM培养基（美国Hyclone）；小牛血清（杭州四季青公司）；Tunel试剂盒(南凯基生物科技发展有限公司)；大蒜素(邵阳医学高等专科学校药学系，0.5g/1，乙醇法提取)。BCL-2基因引物由宝泰克生物技术公司合成；RT-PCRkit（宝生公司）；PCR扩增仪（MinicvclerM7Research）。

2方法

2.1细胞培养将HepG2细胞培养在含量10%小牛血清的DMEM培养基中，培养条件：37℃、100%湿度、5%CO2、95%空气，每24h换液1次。

2.2TUNEL检测细胞凋亡将5×107/L细胞悬液接种于35mm培养皿，将用多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片置于培养皿内，37℃，5%CO2，培养箱中培养，使细胞自然在盖玻片上贴壁生长。24h后分别加人无菌的大蒜素溶液（0.5g/L)10，20，30，40，50μL，使最终浓度分别为50，100，150，200，250mg/L，各组设3个重复，对照组加100μL培养液，在37℃，5%CO2条件下继续培养48h。弃培养皿内的培养液，37℃，PBS轻洗3次，以4%聚甲醛固定。按照原位凋亡细胞检测试剂盒说明书行操作。结果判断标准:在光学显微镜下观察，胞核成棕红色，胞质中有散在较浅着色的细胞为凋亡细，计数至少1000个细胞。凋亡指数=凋亡细胞数/细胞数×100%。

2.3RT-PCR检测Bcl-2基因mRNA表达取培养24h后的HepG2细胞，以Trizol法提取总RNA。逆转录和PCR扩增按RT-PCR试剂盒说明书进行，PCR扩增体系为50μL。Bcl-2、GAPDH的引物由宝泰克生物技术公司合成。Bcl-2mRN探针序列：5＇-GGAGCGTCAACAGGGGATTG-3＇，5＇-GATGCCGGTCAGGTACTCAG-3＇上游引物和下游引物务2μL，Taq酶2U，与逆转录产物cDNA混匀，瞬时离心；扩增条件：94℃2min、92℃1min、55℃45s、72℃1min。GAPDH的引物序列：5＇-ATCACTGCCACTCAGGAGTC-3＇，5＇-TGAGGGAGATGCTCAGTGTT-3＇。GAPDH的扩增条件：95℃5min，94℃1min，55℃lmin，74℃lmin，25个循环，74℃延伸10min。PCR产物利用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。

3结果

3.1大蒜素对肝癌细胞HePG2凋亡的影响镜下检测凋亡细胞数分别为大蒜素对照组(1.58±0.22)(图1)，大蒜素低浓度组(23.08±2.15)(图2)，高浓度组为(37.68±6.28)(图3)；呈剂量依赖效应，证实大蒜素可导致明显的细胞凋亡(P<0.01)。

3.2RT-PCR法检测Bcl-2基因mRNA表达水平15g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外透射灯下观察结果，用凝胶图像扫描分析系统扫描凝胶得到内参对照GAPDH与目的基因的电泳条带光密度，通过目的基因/GAPDH的光密度比值做相对定量分析。用上述方法分析5个实验组的RT-PCR检测电泳结果表明，5个实验组(大蒜素浓度(mg/L)分别为:50，100，150，200，250。大蒜素作用HepG2细胞24h，Bcl-2rnRNA表达水平分别为28.41%，38.65%，47.22%，55.07%，64.01%。由此可见，药物作用24h后Bcl-2mRNA水平随大蒜素浓度降低而上升(如图4)。

图l大蒜素对照组图2大蒜素低浓度组

图3大蒜素高浓度组图4不同浓度大蒜素对Bcl-2mRNA水平的影响(GAPDH内参对照)

4讨论

TUNEL法是检测细胞凋亡的重要方法。TUNEL法检测发现，大蒜素可以明显提高人肝癌HepG2细胞凋亡数目，表明大蒜素对人肝癌HepG2细胞凋亡有较好的促进作用，表明大蒜素联合索拉菲尼对人肝癌细胞的增殖有抑制作用，但其分子作用机制还需进一步研究。

原发性肝癌在我国发病率、死亡率都非常高。大蒜素作为大蒜的主要有效成分，近年来成为抗肿瘤领域的研究热点。现代研究证实[3]，肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致，促凋亡基因活性受抑制和抗凋亡基因被激活是导致肿瘤细胞凋亡被抑制而长期存活的主要原因。Bcl-2基因是一种重要的抑制细胞凋亡的基因[4]，广泛存在于各种肿瘤细胞中，抑制Bcl-2基因的表达可使众多种类的癌细胞进入凋亡，Bcl-2基因的高表达严重影响着肿瘤的发生、发展，并使肿瘤细胞对放疗和化疗产生抵抗。在肝癌、膀胱癌等癌症中均证实Bcl-2基因的过度表达提示患者预后差[5]。本实验研究大蒜素对人肝癌HepG2细胞凋亡人影响和Bcl-2基因的mRNA表达，观察不同浓度的作用结果。RT-PCR实验结果证明大蒜素作用24h后Bcl-2基因mRNA表达水平随药物浓度降低而上升，提示能下调HepG2细胞Bcl-2基因mRNA表达水平，这可能是其诱导HepG2细胞凋亡的重要机制之一，其详细作用机制还需深入研究。

综上所述，大蒜素对HepG2细胞的凋亡作用，对Bcl-2mRNA表达的下调作用机制的阐明为肝癌治疗开辟了新的途径，值得临床广泛推广。

参考文献

[1]BakriIM，DouglasCW．Inhibitoryeffectofgarlicextractonoralbac•tefia[J]．ArchOralBiol，2005，50(7)：645-651．

[2]MilnerJA．PrecliniealperspectivesOnsⅡlicandcancer[J]．Nutr．2006，136(3)：827S-831S．

[3]TakaiN，UedaT，NishidaM，etal．Histonedeacetylaseinhibitorsinducegrowthinhibition，cellcyclearrestandapoptosisinhumanchoriocarcinomacells［J］.IntJMolMed，2008，21（1）：109.

[4]MuQT，QuyangGF，LouYR，etal.Inducing-aPoptosiseffectofborte-ZomibonacutemonocyticleukemiacellSHI-1anditsinfluenceonex-PressionsofBcl-2ll2，Bcl-2andbaxgenes[J]，YeXueZaZhi，2008，16:1016-1020.

[5]CoryS，HuangDC，AdamsJM．TheBcl-2family：rolesincellsurvivalandoncogenesis［J］.Oncogene，2003，22（53）:8590．