短时低速离心法在酶联免疫（ELISA）中代替传统手拍板的可行性研究

短时低速离心法在酶联免疫（ELISA）中代替传统手拍板的可行性研究

瞿聪庄园吕智略周素芳（通讯作者）

瞿聪庄园吕智略周素芳（通讯作者）

（广西医科大学基础医学院广西南宁530021）

【摘要】目的：探讨短时低速离心法在酶联免疫吸附测定（ELISA）中代替传统拍板的可行性。方法：采用间接ELISA，7例样本设置副孔，一组采用短时低速离心法，一组采用传统手拍板，传统手拍组两个96孔板，短时低速离心组四个96孔板，每板样本相同。结果：采用短时低速离心可以在相同时间内完成四个96孔板操作，而传统手拍板只能完成两块96孔板操作。通过独立样本t检验分析比较两组吸光度值，短时低速离心组同一样本最终检测均值与传统手拍板组之间差异无统计学意义（P＞0.05），两种方法检测效果相差不大，但最终检测值稳定性比传统手拍板组更高。结论：采用短时低速离心法更为简单易行，操作稳定，对于间接ELISA检测大批量样本来说，可节省至少一倍时间。

【关键词】短时低速离心；间接ELISA；稳定性

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）14-0030-02

Thefeasibilitystudyofshort-timelowspeedcentrifugationtoreplacetraditionalclappersintheenzyme-linkedimmune(ELISA)QuCong,ZhuangYuan,LvZhilue,ZhouSufang(correspondingauthor).GuangxiMedicalUniversitySchoolofBasisMedicine,Guangxi,Nanning530021,China

【Abstract】ObjectiveDiscussestheshortlowspeedcentrifugationinenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)insteadofthetraditionalclappersfeasibility.MethodsByindirectELISA,7casesofsamplewassetvicehole,asetofusesshortlowspeedcentrifugation,asetofusesthetraditionalhandclappers.Traditionalhandclappersongroupoftwo96-wellplates,short-termlowspeedcentrifugegroupfour96-wellplates,eachplatesamplesarethesame.ResultsUsingshortlowspeedcentrifugecanbefinishedfourpieces96-wellplatesatthesametime,traditionalhandclapperscancompletetwopiecesof96-wellplates.Throughindependentsamplet-testanalysis,comparetwogroupsofabsorbancevalue,short-termlowspeedcentrifugegroupthestabilityofthefinalvalueshigherthanthetraditionalhandclappersgroup.ConclusionsUseshortlowspeedcentrifugemethodismoresimple,theoperationstability,forindirectELISAtodetectlargequantitiesofsamples,cansaveatleastonehalftime.

【Keywords】Short-termlow-speedcentrifugal;IndirectELISA;Thestabilityof

间接ELISA是检测抗体最常用的方法之一，其原理是利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体[1]。特异性抗原与固相载体连接后，洗涤除去未结合的抗原及杂质是其中重要的操作步骤。在一般实验室中，操作者常常使用手拍板的方式来完成洗板操作。但由于操作方式不同以及拍板力度及次数差异，导致不同批次测得结果可能存在差异[2]。本研究采用间接ELISA，用肝癌相关抗原GP73检测肝癌患者血清中抗GP73抗体的血清学分析，比较短时低速离心法与传统手拍板法最终检测结果的差别，分析两种方法操作上的优缺点。

1.材料与方法

1.1材料

肝癌血清由广西医科大学附属肿瘤医院合作提供，所有肝癌病人均经过临床病理证实。所有病人均已签署《知情同意书》,并己通过广西医科大学伦理委员会审查。羊抗人IgG购自CWBIOTECH，avidin-HRP购自武汉博士德生物工程有限公司。GP73抗原为本课题组通过基因工程菌表达纯化后所得。

1.2方法

包被缓冲液将GP73抗原稀释到1.25μg/ml，4℃包被过夜。PBST洗三次，每次浸泡30s。短时低速离心组每次倾倒掉PBST后均在离心机上以300r/min转速离心20s，甩干孔内液体。手拍组采用正常手拍法排净孔内液体。加0.5%BSA封闭，37℃温育1小时。两组均按上述各自洗板方法洗三次（以下不再叙述）。加入稀释后血清（稀释度为1:512），37℃温育1小时。洗板五次，加入生物素化羊抗人IgG（1:5000），温育1小时，洗板五次，加入avidin-HRP（1：9000），37℃温育40分钟，洗板五次。TMB显色15分钟，每孔加100μl2MH2SO4终止液终止反应，酶标仪记录最终检测值。

1.3统计分析

采用SPSS16.0对最终检测结果进行统计学处理、分析，P＜0.05说明差异具有统计学意义。

2.结果

分别比较短时低速离心组和传统手拍组同一样本的最终检测结果之间差异有无统计学意义。另比较两组同一样本同组内检测结果的稳定性。结果显示，两组最终检测结果经独立样本t检验分析，P值均大于0.05（P＜0.05有统计学意义），两组吸光度最终检测值无统计学意义，可认为两种方法检测效果无明显差别。但是传统手拍组标准差普遍高于短时低速离心组，可认为短时低速离心组检测结果更稳定，见表。

3.讨论

ELISA是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术，以其灵敏度高、特异性好的特点在临床得到了广泛应用。但由于人工操作步骤较多，反复人工加样与洗板会引起较大误差[3]。尽量减少人工操作接触是本研究的主要目的。

本研究中，利用离心机产生适当离心力，使未与固相结合的抗原抗体甩出，而已与固相结合的抗原抗体依旧留在板孔内。在排除其他因素的影响下，使用该方法可以最大程度保证洗板这一操作的一致性与稳定性，并使得最终检测结果的准确性有进一步保障。对于大批量ELISA检测来说，采用短时低速离心法能节省更多时间，96孔板之间可以铺垫吸水纸叠加离心，即在保障快速加样的同时，每次可以对8个或者12个甚至更多的板进行洗板操作，极大节省时间。本研究采用水浴法温育，已经最大程度降低边缘效应的影响[4]。但是依旧有少量边缘位置出现较大的异常值，分析认为是短时低速离心法造成，具体原因仍需进一步分析。针对这种情况，可采取以下两种方法来降低对检测结果的影响：（1）96孔板边缘位置不加样处理或者边缘样本可多设置副孔。（2）对边缘位置出现的较大检测值重新进行检测。

影响ELISA检测结果的因素众多，人工洗板造成的影响只是其中之一，要想提高ELISA方法的检测质量，关键还要加强实验室科学管理，强化标准化流程操作，加强质量控制，提高人员素质[2]。

【参考文献】

[1]陈爱华，杨坚.每联免疫吸附（ELISA）法在食品微生物检测中的应用[J].中国食品添加剂，2004，（04）：109-111.

[2]张德志.关于ELISA检测影响因素分析[J].中外医学研究,2010(4).40.

[3]龙贤能.比较化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)与酶联免疫法(ELISA)两种方法检测乙肝表面抗原的灵敏度[J].医学信息，2013（16）.858.

[4]陈鹄，刘庆菊．温育温度及时间对ELISA快速分析法检测乙型肝炎标志物的影响．南华大学学报，2006，34(1)：138—139．

基金项目：国家自然科学基金N0.81160362