锌剂对新生儿光疗中淋巴细胞的保护研究

锌剂对新生儿光疗中淋巴细胞的保护研究

戴上康何秀雯余洽超

（开平市中心医院儿科广东开平529300）

【摘要】目的：观察氧化锌油在高胆红素血症的新生儿光疗治疗中淋巴细胞损伤的保护作用。方法：对154例因未结合胆红素升高而应用蓝光治疗的足月新生儿病理性黄疸患儿，采取随机分组的方法（共两组，每组77例），治疗组在常规光疗组基础上使用氧化锌油外涂治疗，观察分析两组对接受光疗的新生儿出现皮疹、外周血淋巴细胞的损伤情况；同时观察两组患儿光疗前后的血胆红素值改变，比较用药后两组患儿的治疗效果。结果：对照组患儿皮疹发生率为24.7%，治疗组患儿皮疹发生率为6.5%；对照组患儿淋巴细胞损伤为41.6%，治疗组患儿淋巴细胞损伤为18.2%；均明显高于对照组；而两组血中胆红素值改变差异不明显。结论：新生儿光疗时使用氧化锌油外涂治疗对淋巴细胞有预防保护作用。

【关键词】氧化锌油；光疗；高胆红素血症；细胞保护

【中图分类号】R45【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）36-0163-03

新生儿高未结合胆红素血症是新生儿时期最常见的临床症状，发病率高，严重的未结合高胆红素血症可造成中枢神经系统不可逆损伤。由于光疗效果好，方法简单，安全，目前是其治疗的首选方法，但光疗具有一定的副作用，实验已证明胆红素可作为一种光敏感增强因子增加在光疗光线照射下的人体细胞DNA的损伤[1]。而目前针对由于新生儿光疗对细胞损伤的保护研究，国内外报道较少。该文采用氧化锌油外涂对新生儿光疗患儿进行预防性治疗，取得了较好的疗效，现报道如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

本文154例未结合胆红素升高的新生儿为2013年至2015年收住我院新生儿科住院的患儿，其诊断均符合《儿科学》第七版，新生儿病理性黄疸的诊断标准[2]，且在进行蓝光治疗前血清总胆红素值均＞221umol/L(12.9mg/dl),血清结合胆红素≤34umol/L(2mg/dl)；体重2.5～3.5kg。出生后无重度窒息、颅内出血、产伤、败血症、高热、惊厥、严重先天性畸形或遗传性疾病等，并排除胆红素脑病的患儿。所有病例随机分两组，治疗组77例，对照组77例，两组年龄、性别、病程、病情等方面经统计学处理，差异无显著性（P>0.05）。

1.2方法

两组患儿入院后均给予常规蓝光照射治疗，选择波长425～475nm的蓝光单面光疗法，治疗组在常规光疗组基础上使用氧化锌油外涂，药物用至光疗结束；对照组在光疗期间避免应用锌剂。治疗时间为每次24小时，必要时隔12小时后，再照射24小时。总照射时间为24小时～72小时，平均照射时间两组统计无差异显著性（P>0.05）。

1.3单细胞凝胶电泳（彗星试验）检测外周血淋巴细胞损伤

单细胞微量凝胶电泳试验(SCGE)又称彗星试验是一种简便、快速、灵敏、直观检测细胞DNA链断裂的技术，在落射式荧光显微镜下观察到的单个DNA断裂细胞，形态类似彗星拖尾称谓彗星细胞。该试验近年来常用于X射线和化学物质对细胞DNA损伤的检测。

1.3.1主要实验材料与仪器主要试剂和仪器：亚砷酸钠（NaASO2）、氯化汞（HgCl2）、硝酸铅（Pb(NO3)2）均为分析纯，（广州化学试剂厂）；淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）；正常熔点琼脂糖（NMPA）、低熔点琼脂糖（LMPA）（进口分装试剂）；TritonX-100（Merck）；DMSO（Farco）；溴乙锭（EB）（Sigma）。DYY-7型转移电泳仪（北京六一仪器厂）；荧光显微镜（Nikon）。

1.3.2实验方法

（1）光疗结束后,于患儿出院前采集外周血液2ml,先用PBS稀释1倍，然后用淋巴细胞分离液（2000r/min×25分钟，1次；1000r/min×10分钟，2次），并用PBS稀释成含细胞约1×106/ml的细胞悬液。

（2）单细胞凝胶电泳程序：取100ul0.5%w/v正常熔点琼脂糖（55±2）℃，加在磨沙载玻片上，用盖玻片压平胶面，40C放置10分钟，然后轻轻将盖玻片移开制成底层胶，取70ul0.8%低熔点琼脂糖（370C），与20ul体积的淋巴细胞悬液混匀，铺于底层胶上，用盖玻片压平，40C放置10分钟，移去盖玻片。取100ul0.8%低熔点琼脂糖（370C），铺于第二层胶上，用盖玻片压平胶面，40C放置10分钟，然后轻轻将盖玻片移开。再将制成的胶板放置于40C裂解液（2.5mol/lNaCl,100mmol/lNaEDTA.2H2O,10mmol/l三羟甲基氨基甲烷，1%TritonX-100，10%DMSO,PH10），裂解30分钟。取出胶板，水平放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液（1mmol/lNaEDTA.2H2O，300mmol/lNaOH,PH13），40C放置20分钟，在25V、300mA条件下电泳20分钟。将胶板取出置于盛有中和液（0.4mmol/lTris-HCL,PH7.5）的大平器中，中和2次，每次5分钟（40C）。再用25ug/ml的EB在暗处染色5分钟。

（3）观察：以100W汞灯作为荧光电源，在荧光显微镜下（激发波长549/10nm，抑制波长590nm），每片随机观察约100个细胞，依据DNA在“彗星细胞”尾部的量对DNA损伤程度进行分级。

1.4细胞损伤的判断标准

彗星细胞的频数分布根据总慧尾长度将细胞分为5级。

（1）Ⅰ级（＜15um）:无细胞损伤，无慧尾；

（2）Ⅱ级（15-30um）:细胞轻度损伤，有少量慧尾；

（3）Ⅲ级（30-45um）:细胞明显损伤，慧尾明显可见；

（4）Ⅳ级（45-60um）:细胞重度损伤，慧尾长，向阳极平行拖开；

（5）Ⅴ级（＞60um）:细胞严重损伤，慧尾长，呈扇形。

1.5疗效判断

观察分析两组患儿对接受光疗治疗后，新生儿出现皮疹、外周血淋巴细胞的损伤情况，同时观察两组患儿光疗前后的血胆红素值改变，比较用药后两组患儿的治疗效果。

1.6统计学处理采用t检验及χ2检验。

2.结果

2.1两组患儿皮疹出现情况比较

治疗组和对照组的患儿治疗期间皮疹出现率分别为6.5%和24.7%，差异有统计学意义（χ2=9.68，P<0.01）。治疗组皮疹发生率明显低于对照组，见表1。

3.讨论

由于新生儿出生后环境的改变，导致红细胞寿命较短而降解增多等因素，引起新生儿黄疸的发病率超过50%，部份由于进展快，胆红素负荷增加并通过不成熟的血脑屏障而对脑部造成实质的损害；目前临床上常规应用蓝光治疗，新生儿光疗可有效降低血清未结合胆红素，预防胆红素脑病的发生，极大地降低了交换输血疗法的使用频率。蓝光治疗黄疸的原理，是皮肤及皮下微循环的未结合胆红素通过在蓝光的作用下，转变成水溶性的光红素，能快速从胆汁和尿液中排泄体外。尽管光疗在新生儿黄疸患儿中的应用已经超过半个世纪，但光疗的确切机制尚未完全明确，且目前国际上对开始光疗的阈值也尚未达成共识，其应用存在非常大差异，传统观点认为，光疗只有很少的近期副作用，是一种无害的疗法。但近年研究发现，光疗具有一系列副作用，新生儿未成熟皮肤在接受大剂量的蓝光照射后人体细胞DNA的损伤发生率是值得关注的问题，加之新生儿皮肤抗氧化能力较弱，免疫防御机制不完善，增加了皮肤的易损性，蓝光可直接诱导氧自由基产生，导致细胞线粒体和胞核DNA损伤，促进皮肤癌的进展。因此，关注光疗副作用和规范光疗应用，具有重要的临床意义。近年由于新生儿光疗所致的细胞DNA损伤逐渐引起国内专家的关注，有报道对新生儿高未结合胆红素血症进行光疗72小时后，观察新生儿慧星细胞出现频率明显增高，并提示光疗时间愈长，DNA损伤愈严重，且2天后仍未能自行恢复[3]。有研究表明氧化锌油对治疗光疗期间的新生儿臀红效果显著[4]。

本文对154例患儿进行了对照性研究，资料结果显示，对照组患儿皮疹发生率达24.7%，说明光疗对患儿皮肤影响明显；应用氧化锌油外涂后皮疹出现率明显下降与上述研究结果一致；外周血淋巴细胞的损伤率在未有氧化锌油预防性治疗时发生率更高达41.6%，是重度损伤率为9.1%，应用氧化锌油外涂预防治疗后，发生率明显下降；而两组患儿光疗前后的间接胆红素值改变无显著性差异，说明应用氧化锌油外涂对新生儿光疗的患儿进行治疗，能减轻光疗的并发症，减少皮疹的发生及细胞损伤，而对光疗治疗黄疸效果无明显影响，临床疗效好，可能是锌剂在新生儿光疗中发挥重要作用有关。在研究对36例患有新生儿高胆缸素血症的足月儿光疗前后进行血锌分析，结果显示高胆红素患儿血锌在光疗后出现明显下降[5]。锌是人体必需的微量元素之一，在新生儿期对人体的结构、生长发育及修复作用有明显作用。有关研究证实锌剂是人体的生命元素，参与体内DNA和RNA的代谢过程，直接参与核酸、蛋白质的合成，从而影响细胞的分裂、生长和再生，对细胞的分化和增殖有促进作用，增强人体细胞的保护性能[6]；另外氧化锌油可以保护未成熟的新生儿皮下组织。目前人们对微量元素锌影响人体免疫功能的研究已经比较深，锌对免疫系统的发育和正常免疫功能的维持有重要作用，锌对免疫功能的影响是多方面的，研究表明其影响甚至可能从皮肤粘膜的屏障功能一直到淋巴细胞的基因调节；且锌对特异性和非特异性免疫功能均有明显影响，目前在体外实验以及人类锌缺乏模型中均已证实。锌对CD4细胞有明显影响，尤其是主要介导细胞免疫的Thl型细胞的活性，造成Thl／Th2不平衡，而致抗感染能力失调。本研究表明：氧化锌油外涂可在新生儿光疗时对细胞产生预防性保护性作用，值得临床推广应用。

【参考文献】

[1]RosensteinBS,DucoreJM.EnhancementbybilirubinofDNAdamageinducedinhumancellsexposedtophototherapylight.PediatrRes.1984Jan;18(1):3-6.

[2]沈晓明，王卫平.儿科学[M].第7版.北京:人民卫生出版，2011.115.

[3]周晓玉，徐美英，张小琼.光疗对新生儿慧星细胞频率影响的研究[J].临床儿科杂志，2003，21（6）：351-353.

[4]黄润萍，邵霞.氧化锌油外涂预防光照疗法引起新生儿臀红的观察[J].中国医疗前沿月刊，2009，15（4）；104.

[5]幸彦，柯志勇，丘小汕.蓝光治疗对高胆新生儿微量元素的影响[J].微量元素与健康研究，1998，15（3）44.

[6]胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社，2009.550.