信号传导阻滞剂AG490对膀胱癌细胞侵袭转移的影响及其机制研究

信号传导阻滞剂AG490对膀胱癌细胞侵袭转移的影响及其机制研究

姚林方1叶章群2陈志强2甘卫东1郭宏骞1

姚林方1（通讯作者）叶章群2陈志强2甘卫东1郭宏骞1

（1南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科江苏南京210008）

（2华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科湖北武汉430030）

【摘要】目的观察AG490对膀胱癌细胞侵袭转移的影响，探讨通过药物阻断STAT3信号转导通路在抑制膀胱癌细胞侵袭转移中的作用。方法应用AG490处理膀胱癌细胞系BIU-87，以肿瘤侵袭模型检测膀胱癌细胞侵袭转移能力，以免疫组织化学SP法检测肿瘤微血管密度(MVD)，Westernblot检测p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶组织抑制因子2（TIMP-2）及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达。结果AG490抑制STAT3单体活化为p-STAT3，明显抑制膀胱癌细胞侵袭能力，裸鼠皮下移植瘤MVD值在AG490组(34.8+2.5)显著低于对照组[(46.2+6.6)，P<0.01]，抑瘤率达74.49%；并抑制MMP-2、VEGFmRNA的表达，同时上调TIMP-2mRNA的表达。结论AG490通过阻断STAT3通路，抑制膀胱癌细胞的侵袭和转移。病理性肿瘤血管生成减少及MMP-2、TIMP-2、VEGF表达改变与AG490抗肿瘤侵袭转移作用密切相关。

【关键词】膀胱癌AG490信号转导通路肿瘤侵袭

【中图分类号】R73-37【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）15-0122-02

STAT3信号转导通路异常活化与细胞异常增殖和恶性转化密切相关[1]。研究发现JAK（Januskinase）激酶抑制剂α-氰基-（3，4-羟基）N-苄苯乙烯胺（AG490）可特异性阻断STAT3信号转导通路，是该通路的特异性阻滞剂[2]。本研究旨在观察AG490对STAT3通路以及膀胱癌细胞侵袭转移的影响，探讨通过药物阻断STAT3信号转导通路在抑制膀胱癌细胞侵袭转移中的作用。

材料和方法

1.材料：膀胱癌细胞系BIU-87（编号：GDC120）购自中国典型培养物保藏中心，用含10%胎牛血清（天津TBD公司）的完全RPMI1640培养液（美国Gibco公司），在37°C、5%CO2培养箱中培养。BALB/c裸小鼠(nu/nu)购自中国科学院上海实验动物中心，雄性，4～6周龄，体重18～22g。AG490为美国Calbiochem公司产品（M.W.=294.3，批号：658401）。Chemicon细胞侵袭试剂盒购自美国Chemicon公司。兔抗人FⅧ因子相关抗原（FⅧRAg）多克隆抗体为美国Zymed公司产品。Trizol试剂购自美国Gibco/Brl公司。Westernblot采用一抗（美国SantaCruz公司）和碱性磷酸酶标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。RT-PCR试剂盒购于Fermentas公司。

2.细胞侵袭能力的检测：用无血清RPMI1640培养基水化Chemicon小室的基底膜，在放置有Chemicon小室的孔中加入500μl按1：1混合的条件培养液和完全培养液，在小室内加入300μl肿瘤细胞悬液，密度为1.0×106个/ml，实验组加入AG490溶液至终浓度为100μmol/L，对照组加入等体积溶剂，37°C、5%CO2培养箱中分别培养24、48、72h后取出Chemicon小室，擦净小室内层的未穿透细胞，磷酸盐缓冲溶液漂洗后95%乙醇固定，苏木素染色，漂洗风干后在倒置显微镜下计数10个视野内的穿透微孔膜的细胞，取均值。每组重复4个样本。

3.膀胱癌体内侵袭模型：用碘伏消毒裸鼠接种部位，用带6号针头的注射器抽取膀胱癌细胞悬液接种于裸鼠背部皮下，每个部位注射0.2ml(含5×106个活细胞)，待瘤块直径达0.5～1.0cm时，即将动物随机分组，每组6只。实验组腹腔注射AG490溶液，每次注射10mg/kg体重。对照组腹腔注射相应溶剂。以上两组均隔日注射1次，4d测肿瘤体积1次，用药21d颈椎脱位处死裸鼠，完整剥离瘤体，分别称量瘤重。肿瘤体积（cm3）以长×宽2×0.5计算。抑瘤率(%)=(1-用药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%。

4.肿瘤微血管密度(MVD)检测:组织标本常规石蜡包埋、切片,SP法行FⅧRAg因子免疫组织化学染色。采用Weidner计数方法，在低倍镜下选择5个血管染色最密集区域，计数微血管数量，取平均值。

5.Westernblot法：参照美国SantaCruz公司提供的蛋白提取方法，收集细胞后用细胞裂解缓冲液（50mmol/LTris-HClPH7.4，150mmol/LNaCl，0.1%SDS，1%NP-40，0.5%去氧胆酸钠，0.02%叠氮钠，100μg/mlPMSF，1μg/mlAprotinin）于冰上裂解细胞得到细胞总蛋白。以Bradford法作蛋白定量后，取50μg蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶（5%积层胶，10%分离胶）电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜，37℃封闭1h后，分别加入1：1000稀释的一抗p-JAK2、STAT3、p-STAT3（内参为GAPDH）后4℃过夜，加入碱性磷酸酶标记的二抗检测杂交蛋白。

6.RT-PCR：用Trizol一步法提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA。根据GenBank序列，利用Oligo6.0和PrimerPremier5.0软件设计引物（表1）。50μlPCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μl，25mmol/LMgcl24μl，10mmol/LdNTP2μl，100μmol/L上游及下游引物各1μl，TaqDNA聚合酶1μl，cDNA模板2μl，补足ddH2O至50μl。MMP-2的PCR反应条件：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，共35个循环，72℃后延伸10min，4°C终止反应。TIMP-2、VEGF、β-actin的退火温度分别为55、57、60oC，其余PCR反应条件同上。取5μl扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100V，用自动电泳凝胶成像分析仪Chemi-Imager5500采集和分析数据。

表1引物序列表

注：引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

7.统计学方法：数据以均数+标准差（x±S）表示，各处理组与对照组之间采用两样本均数比较的t检验(双侧检验)。

结果

1.肿瘤细胞侵袭能力：膀胱癌BIU-87细胞在侵透人工基底膜及8μm微孔后附于聚碳酸酯膜下层。AG490使侵透人工基底膜的细胞数明显减少，抑制了膀胱癌BIU-87细胞的侵袭，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01，表2）。

表2各处理组中膀胱癌BIU-87细胞侵透人工基底膜的细胞数（n=4，ˉx±S）

注：与对照组比较，*P<0.01

2.膀胱癌移植瘤生长：膀胱癌细胞接种于裸鼠皮下1周后，可见背部成形的瘤块，移植成功率为100%。AG490组与阴性对照组比较，其肿瘤生长速度显著减慢。用药21d后处死所有裸鼠。AG490组移植瘤的体积、瘤重显著低于阴性对照组(P<0.01，表3)，抑瘤率为74.49%。解剖瘤块并行组织学检查可见AG490组瘤组织表面有较完整的纤维包膜，易分离，而对照组包膜不完整，浸润侵犯周边组织。

表3AG490对裸鼠移植瘤体积和瘤重的影响（n=6，x±S）

注：与对照组比较，*P<0.01

3.移植瘤MVD检测：裸鼠皮下移植瘤MVD值在AG490组(34.8+2.5)显著低于对照组[(46.2+6.6)，P<0.01]，这表明AG490对膀胱癌移植瘤的血管生成具有显著抑制作用（图1和2）。

4.STAT3信号通路成员蛋白表达：AG490作用于BIU-87细胞72h后，JAK2活化蛋白p-JAK2和STAT3蛋白及其活化蛋白p-STAT3表达与活性明显下降（图3）。AG490明显抑制膀胱癌BIU-87细胞中STAT3磷酸化及STAT3信号转导通路的活化。

5.STAT3信号通路下游靶基因mRNA的表达：AG490可下调BIU-87细胞MMP-2、VEGFmRNA的表达，在不同时间点，MMP-2、VEGFmRNA的表达均低于对照组，作用72h后明显下降（图4）。同时AG490上调TIMP-2mRNA的表达，作用72h后较对照组有明显增加（图4）。

讨论

STAT3信号转导通路是调控细胞增殖、分化及凋亡的重要的细胞内信号转导通路。JAK2作为上游激酶活化后募集胞浆中的STAT3单体，使无活性的STAT3分子酪氨酸磷酸化而形成有活性的二聚体，转移入细胞核，结合DNA，导致特定靶基因的开启，并可促进自身基因的加速表达[3]。近年来研究发现，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演进[1]。研究发现在血液系统肿瘤、乳腺癌和前列腺癌等多种肿瘤组织中，STAT3信号转导通路异常激活，阻断该通路成为肿瘤治疗的新靶点。目前，已经发现作为JAK2激酶抑制剂AG490是STAT3通路的特异性阻断剂。

本研究通过Westernblot分析表明AG490抑制STAT3单体活化为p-STAT3，并可阻断STAT3单体形成的正反馈，抑制STAT3单体形成，从而有效地阻断了STAT3通路的活化。通过体内和体外肿瘤细胞侵袭实验发现STAT3通路参与调控膀胱癌的侵袭和转移，利用该通路的阻滞剂AG490可明显抑制膀胱癌细胞的侵袭转移，使移植瘤的血管生成显著减少，抑瘤率达74.49%。

膀胱癌的恶性度以及侵袭转移能力与金属蛋白酶类异常高表达密切相关,MMP-2在此过程中起十分重要的作用。MMP-2是降解Ⅳ型胶原最主要的酶之一,而TIMP-2是MMP-2的特异性抑制因子,通过与MMP-2结合形成复合物而抑制MMP-2的活性，两者的相互平衡在肿瘤的血管化、肿瘤细胞浸润和转移灶的形成过程中起重要作用。本研究显示,通过AG490阻断STAT3通路后抑制了膀胱癌细胞MMP-2的表达,同时使TIMP-2表达上调，提示STAT3通路参与调控基质金属蛋白酶（MMPs）与其抑制因子TIMPs的相互平衡。血管生成在肿瘤的生长和转移中发挥关键作用。VEGF是膀胱癌重要的血管生成因子。AG490阻断STAT3通路后，VEGF的表达亦受到抑制，提示VEGF是STAT3通路的又一靶基因。由此可见，AG490通过阻断STAT3通路，使该通路下游与肿瘤侵袭转移相关的靶基因的异常表达得到纠正，抑制了膀胱癌细胞的侵袭和转移。但其具体作用机制有待进一步研究。

参考文献

[1]HodgeDR，HurtEM，FarrarWL.TheroleofIL-6andSTAT3ininflammationandcancer[J].EurJCancer，2005，41(16)：2502-2512.

[2]SeoIA,LeeHK,ShinYK,etal.JanusKinase2InhibitorAG490InhibitstheSTAT3SignalingPathwaybySuppressingProteinTranslationofgp130[J].KoreanJPhysiolPharmacol,2009,13(2)：131-138.

[3]SiejkaA,SchallyAV,BarabutisN.ActivationofJanuskinase/signaltransducerandactivatoroftranscription3pathwaybygrowthhormone-releasinghormone[J].CellMolLifeSci,2010,67(6):959-964.