凋亡和Ki-67在宫颈癌新辅助化疗前后表达的意义

凋亡和Ki-67在宫颈癌新辅助化疗前后表达的意义

杨艳青

杨艳青(哈尔滨市第四医院病理科150026)

【中图分类号】R737.33【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）48-0009-02

【摘要】目的探讨宫颈癌组织细胞增殖和凋亡与新辅助化疗疗效的关系。方法采用免疫组织化学S-P法检测60名宫颈癌病人新辅助化疗前后宫颈癌组织中ki-67表达阳性率的差异;用TUNEL法检测化疗前后宫颈癌组织中细胞凋亡阳性率的差异。结果宫颈癌新辅助化疗后：组织疗效评定，有效率为（37/60）61.7%；ki-67在化疗前后的表达阳性率分别为73.3%、36.7%，差异有显著性（P<0.05）；化疗前后凋亡阳性率分别为33.3%、61.7%，表达差异有显著性（P<0.05）；组织学无效、有效的病例在化疗前宫颈癌组织中：ki-67的阳性率分别为91.3%、62.2%，差异有显著性（P<0.05），凋亡的阳性率分别为9.0%、48.6%，差异有显著性（P<0.05）。结论新辅助化疗能抑制宫颈癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡；细胞增殖和凋亡有可能成为预测化疗疗效的指标。

【关键词】宫颈癌ki-67凋亡新辅助化疗

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，位居女性恶性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌。由于手术和放射治疗的应用，早期宫颈癌有较高的生存率，Ib,Ia期患者5年生存率为75%-90%，但是晚期宫颈癌或复发癌预后极差。近年来，宫颈癌术前或放疗前的化学治疗(neoadjuvantchemotherapy,NACT)越来越受到国内外学者的重视。化疗前后肿瘤细胞的病理、细胞增殖动力学、细胞凋亡和分子生物学改变等研究也逐步深入。细胞增殖和细胞凋亡的高低直接与肿瘤的消长相关，为此我们观察了新辅助化疗前后宫颈癌组织中细胞增殖和凋亡的表达情况，现报告如下。

1材料与方法

1.1临床资料所有标本均来自本医院病理科存档蜡块（2008年-2011年）。HE切片均经镜下病理检查证实，60名病人均具备化疗前后组织共120个样本(化疗前均未进行任何治疗)，宫颈癌组织经病理诊断其中鳞癌45例，腺癌15例，宫颈癌的临床分期（FIGO）：Ⅰb期2例，Ⅱb期30例，Ⅱa期7例，Ⅲb期17例，Ⅳ期4例，宫颈癌组织分化程度：低分化16例，中分化32例，高分化3例，中低分化9例，年龄从28-70岁之间，中位年龄49岁。

1.2研究方法

1.2.1试剂：免疫组化及TUNEL法原位杂交试剂盒均购于福州迈新生物技术有限公司。

1.2.2免疫组化方法：将存档的福尔马林固定、石蜡包埋组织行4μm连续切片,作HE染色和SP免疫组化染色，免疫组化SP法严格按照说明书操作步骤进行,DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片,显微镜下观察用已知阳性切片作阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照,并用高压锅对组织抗原进行修复处理。

1.2.3末端标记技术染色方法及步骤：载玻片防脱片剂APES处理,石蜡切片脱蜡至水,PBS洗。蛋白酶K(20mg?L-1于10mmol?L-1TrisHClpH8.0溶液中),37℃消化30min,PBS洗。0.3%H2O2(体积分数)封闭,室温30min,PBS洗。DAB显色底物5min,显色满意后双蒸水冲洗,停止显色,苏木素衬染。脱水、透明、封片。阳性对照只加标记混合液,不加末端脱氧核苷酸转换酶溶液。

1.2.4治疗方案：均采用顺铂（江苏豪森药业股份有限公司）联合化疗DDP50mg/m2，静注，第1天（先水化）；VCR1mg，静脉冲击疗法，第1天；BLM20mg/m2，静滴，第1-3天。每3周重复一次，共2个周期。

1.2.5结果判定：Ki-67结果判定：以肿瘤细胞核出现明显的棕黄色颗粒为阳性表达。根据阳性肿瘤细胞占全部肿瘤细胞的比例将阳性结果分为4级，（-）：阳性细胞<10％；（+）：阳性细胞10％；（++）：阳性细胞介于10％～60％之间；（+++）：阳性细胞＞60％。

TUNEL结果判定标准：鉴于化疗后组织出现片状、灶状坏死，采用凋亡强度进行评判。凋亡细胞阳性定位于胞核，为蓝黑色颗粒。选择凋亡明显的4个区域，在10X低倍镜下数凋亡小体，取其均值。凋亡强度分为三级（强阳、阳性、阴性）：凋亡小体＞7/10X视野为强阳；3-7/10X视野为阳性；＜3/10X视野为阴性；强阳和阳性视为阳性。

化疗效果的判断：宫颈癌化疗后组织学疗效评定标准：以细胞损伤程度进行病理疗效评定，根据细胞损伤程度分为三级：HE切片观察Ⅰ级：癌细胞无变化或轻度变性，见核分裂，癌巢处于增值状态，为无效。Ⅱ级：大部分癌细胞肿胀或固缩，胞浆空泡形成，灶性坏死，部分区域可见明显片状坏死，整个癌巢处于重度变性状态，为有效。Ⅲ级：多数癌细胞破坏，崩解成碎片以致消失，残留的少数癌细胞处于退化变性，癌巢崩解或消失，为显效。

1.2.6统计学处理应用SPSS统计软件16.0进行X2检验。

2结果

2.1宫颈癌化疗后HE组织切片镜下疗效评定Ⅰ级23例，Ⅱ级30例、Ⅲ级7例，有效率为61.7%。

2.2宫颈癌化疗前后ki-67表达的变化化疗前后ki-67表达阳性率分别为：73.3%、36.7%，经X2检验有显著差异性，X2=16.615a，P<0.05（P=0.001）。表达强度化疗后明显减弱。见表1。

2.3宫颈癌化疗前后凋亡阳性率的变化凋亡阳性率=(强阳+阳性)/总例数×100%在化疗前后凋亡阳性率分别为：33.3%、61.7%，经X2检验有显著性差异,X2=9.811a,P<0.05(P=0.007)。凋亡强度化疗后较化疗前明显增强。见表1。

表1宫颈癌新辅助化疗前后ki-67、凋亡阳性率的表达

2.4宫颈癌化疗后组织学无效、有效的病例在化疗前癌组织中：ki-67的阳性率分别为91.3%、62.2%，经X2检验差异有显著性X2=6.160a，P<0.05（P=0.016）；凋亡的阳性率分别为9.0%、48.6%，经X2检验差异有显著性X2=10.188a，P<0.05（P=0.001）；见表2

表2宫颈癌新辅助化疗后无效和有效病例在化疗前ki-67、凋亡的表达

3讨论

子宫颈癌的主要治疗手段有手术和放疗。新辅助化疗可以提高根治性手术或放疗疗效，近几年受到妇科肿瘤界的关注。Kuzuya[1]报道以顺铂为基础的联合化疗方案治疗Ib-IIb期宫颈癌后再进行根治手术，可提高患者的5年生存率。其近期效果更是在诸多临床研究中得到肯定。本研究中所采用的化疗方案亦是以顺铂为基础的联合用药。经过2个周期的治疗，组织学疗效评定有效率达到61.7%，与Sultan等[2]报道相近。宫颈癌的发生、发展及与治疗相关的转归等与肿瘤细胞的增殖与凋亡状态密切相关。二者表现程度决定了肿瘤的消长。学者常选用增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67、细胞增殖指数和凋亡等反映肿瘤细胞的增殖或凋亡状态。

Ki-67抗原是一种与细胞增殖相关的核抗原,存在于细胞周期的G1、S、G2、M期,而在G0期细胞中则不表达,其表达与细胞增殖密切相关。Ki-67是近年来研究最多、最具有前途的增生标记物,化疗后标本的Ki-67水平对于预测化疗的反应具有重要的意义[3]。本研究表明子宫颈癌新辅助化疗前后ki-67表达阳性率分别为：73.3%、36.7%，差异有显著性（P<0.05）。化疗后表达强度明显减弱。提示新辅助化疗抑制宫颈癌细胞增殖。与文献报道[4]相符。

细胞凋亡是基因调控下的细胞自主死亡过程。随着分子生物学的发展及人们对细胞凋亡与肿瘤发生关系的不断深入研究，认为细胞凋亡是生物体内普遍存在的一种生理性现象，细胞的增殖与凋亡相互平衡才能维持组织器官正常的生理功能和细胞数的稳定，如果细胞增殖过度而凋亡受阻则可以导致肿瘤的发生，因此细胞凋亡受阻是肿瘤发病的重要机制之一。目前临床上大部分的化疗药物作用均为从细胞分化的不同阶段抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而达到控制或者消灭肿瘤的目的。在本研究中，子宫颈癌新辅助化疗前后凋亡阳性率分别为：33.3%、61.7%，有显著性差异(P<0.05)。化疗后凋亡强度明显增强。并且凋亡强度结果与组织学疗效（有效率61.7%）相符合。提示新辅助化疗具有抑癌的作用，并且该作用与诱导癌细胞发生凋亡相关。这与Sushma等[5]研究结果相一致。

随着新辅助化疗在临床的应用，特别是对于局部晚期宫颈癌，以其能降低肿瘤分期、增强手术可切除性、提高手术效果、增加放疗敏感性、减少不良预后因素的作用[6]等优点而受到妇科肿瘤界的关注，近年来新辅助化疗已成为现代处理宫颈癌的一个重要策略。研究证实，大多数的化疗药物都是通过诱导细胞凋亡清除肿瘤细胞[7]。因此，检测肿瘤细胞增殖和凋亡标记物的表达水平，可能有助于预测新辅助化疗疗效和判断预后。本研究表明宫颈癌化疗后组织学无效、有效的病例在化疗前癌组织中：ki-67的阳性率分别为91.3%、62.2%，差异有显著性（P<0.05）；凋亡的阳性率分别为13.0%、62.2%，差异有显著性（P<0.05）；提示ki-67和凋亡程度与新辅助化疗疗效有相关性。符合Kamoi等[8]的文献报道。

综上所述，以顺铂为主的新辅助化疗能够抑制宫颈癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡，并且细胞增殖和凋亡有可能成为预测化疗疗效的指标。

参考文献

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