青藤碱对宫颈癌SiHa细胞株的增殖抑制研究

青藤碱对宫颈癌SiHa细胞株的增殖抑制研究

雷佳红蒋红杨明辉

川北医学院风湿免疫研究所检验系四川南充637000

摘要：目的：研究青藤碱（Sinomenine，SIN）对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。方法：用不同浓度SIN（0、62.5、625、1250、2500ug/ml）分别处理SiHa细胞后，用倒置显微镜观察细胞形态学改变，分别于24小时、48小时后用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组细胞生长情况，并用统计软件SPSS16.0对结果进行分析。结果：青藤碱对SiHa细胞增殖有抑制作用，且随着药物浓度的增加其抑制作用增加，与对照组0ug/ml比较，差异有显著性。结论：青藤碱能显著抑制宫颈癌SiHa细胞增殖。

关键词：青藤碱；宫颈癌细胞株；细胞增殖

[Abstract]Objective：Tostudytheeffectsofsinomenine（Sinomenine，SIN）ontheproliferationofcervicalcancerSiHacells.Methods：Usingdifferentconcentrationsofsin（0，62.5，625，1250，2500ug/ml）treatwithSiHacellsrespectively.Andthen，thechangesofcellmorphologywereobservedbyinvertedmicroscope，theproliferationweredetectedbythemethodofMTTafter24、48hours.TheresultswereanalyzedbystatisticalsoftwareSPSS16.0.Results：SinomenineinhibitedtheproliferationofSiHacells，andtheeffecthasmoreprominentasthedrugconcentrationincreased，thedifferencesateachconcentrationwassignificantwhencomparedwithcontrolgroup（0ug/ml）.Conclusion：SinomeninecaninhibittheproliferationofSiHacells.

青藤碱（SIN）是一种从青风藤（）中提取的生物活性碱，其分子式：C19H23N04分子量：329.38。SIN具有抗炎、抗血管生成、抗风湿、抗心律失常、免疫抑制以及镇痛等药理作用，用于治疗类风湿性关节炎已有近千年的历史。近年来，有学者研究发现青藤碱具有一定的抗肿瘤作用。我们拟在体外观察青藤碱对宫颈癌SiHa细胞生长、增殖的影响，为其在抗肿瘤方面的作用提供一定的实验数据，扩大青藤碱的应用范围。

1材料及方法

1.1主要试剂

SIN干粉（含量98%，性状为白色粉末，湖南正清药业有限公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT）（美国Sigma公司），用0.1mol/L、PH值为7.2的磷酸盐缓冲液配制为5mg/ml于-20℃保存备用；二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；胰蛋白酶（美国Amreseo公司）；RPMI1640培养基（美国GIBCO）；新生牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所）。

1.2细胞系

宫颈癌细胞株SiHa细胞由川北医学院附属医院风湿免疫研究所保存。

1.3仪器设备

倒置显微镜（OLYMPUS），酶标仪（TECAN2000）。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养：人宫颈癌细胞株siha细胞用RPMI1640培养基（含10%胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素）于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。根据细胞生长状态每2-3天传代一次。当细胞生长状态稳定，呈对数生长期，用0.25%胰酶消化细胞，按每孔1000个细胞作用（每孔终体积200ul）传代至96孔板中继续培养，待贴壁后进行后续实验。

1.4.2药物分组将青藤碱按浓度不同分为100umol/L、200umol/L、400umol/L、800umol/L、1600umol/L共5组。对照组为等体积细胞的培养液。SIN用PBS溶解，培养液稀释，现配现用。每组设6个复孔，另设不含药物和细胞的空白对照孔和不加细胞仅加药物的对照孔（以排除药物对实验结果的干扰）。

1.4.3MTT检测：观察96空微量反应板中的细胞，24小时后吸出原培养液，按以上分组情况加药，继续培养24、48小时后，进行MTT实验：每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20uL，继续培养4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO150uL，振荡10分钟，使结晶充分溶解，用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度值（OD490），参考波长为630nm，按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%）=（对照组OD490-用药组OD490）/对照组OD490×100%。

1.4.4统计学分析

实验结果用均数+标准差（）表示，采用统计软件SPSS16.0对同一时间点组间比较进行单因素方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1青藤碱对SiHa细胞形态的影响

与对照组比较，各浓度SIN作用人SiHa细胞24h后，细胞数量明显减少，且呈浓度依赖性，同时，细胞形态发生改变，将对照组与实验组置倒置显微镜下观察细胞形态（图1A、B），发现对照组细胞数量多，细胞呈上皮样贴壁生长，细胞间结构紧密，生长旺盛。而实验组细胞在加药后24h，可见大部分细胞变圆，胞体增大，胞内可见大小不等的空泡样结构，呈凋亡样细胞改变，细胞核边移，但大部分细胞膜尚完整。

2.2.2不同浓度青藤碱对SiHa细胞的增殖活性影响

不同浓度青藤碱（100umol/L、200umol/L、400umol/L、800umol/L、1600umol/L）处理SiHa细胞24h、48h，其对SiHa细胞的增殖抑制率与对照组相比，有显著差异（P＜0．05）。不同浓度的青藤碱处理SiHa细胞24小时和48小时后的吸光度值与抑制率均具有显著差异（P＜0．05）。结果如表1所示，

3讨论

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，寻找有效的抗癌药物和方法，是世界医学面临的重要课题。中药是祖国医学用来防治疾病的有利武器，人们发现中药治疗恶性肿瘤，无论是在减轻临床症状、提高生存质量、防止复发转移、延长生存期等方面，还是在与放化疗配合、增效减毒等方面都有很好的效果。

全球范围内宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，占所有女性恶性肿瘤发病的13%。在我国，宫颈癌每年新发病例约在11万以上，且每年约有2-3万女性死于宫颈癌。因此，寻找新的治疗药物已经成为宫颈癌研究的重点和难点。

1992年英国科学家Hickman等首次提出诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗中的主要目标和手段。目前肿瘤细胞诱导凋亡治疗逐渐成为国际肿瘤研究的一个热点。研究发现，宫颈癌的发病机制与细胞增殖凋亡的失衡有密切关系，宫颈癌的迅速生长是癌细胞增殖旺盛与凋亡减少的结果。青藤碱是从青风藤中分离得到的一种生物碱单体。其药用功效最早见于宋朝《图经本草》和明朝《本草刚木》，现在已有正清风痛宁片及注射液等制剂药用于临床，治疗类风湿关节炎等各种风湿病以及心律失常。目前对于SIN药理作用的研究多集中在抗炎和免疫抑制方面，在细胞凋亡方面的报道较少。最新的研究表明，青藤碱可以抑制大鼠肾小球系膜细胞及成纤维样滑膜细胞的增殖。我们的实验研究发现，青藤碱处理SiHa细胞后，与对照组相比细胞数量明显减少，而细胞形态则不规则，出现了核固缩、染色体凝集等细胞凋亡的形态学特征。而且随着青藤碱浓度的升高，细胞凋亡的特征就愈发明显，因此青藤碱能抑制SiHa细胞的增殖，可能诱导SiHA细胞凋亡，通过对细胞凋亡相关的基因进行调控而达到促进癌细胞凋亡的目的。

综上所述，青藤碱能够有效抑制宫颈癌细胞株SiHA的体外增殖活性，促进细胞的凋亡，但其作用机制仍需进一步的探讨和研究，为其在临床上的应用提高更加可靠的理论依据。

参考文献：

[1]张培.苦参碱对宫颈癌SiHa细胞增殖的抑制作用及其对JAK-STAT通路的影响[D].兰州大学，2014.

[2]鲁永婷.氧化苦参碱对人宫颈癌SiHa细胞株增殖及凋亡的影响[D].兰州大学，2014.

[3]张培，王海琳，张恒亮，秦会影，刘钰，毛燕.苦参碱对宫颈癌SiHa细胞增殖的抑制作用及JAK-STAT信号通路的影响[J].现代肿瘤医学，2014，08：1790-1793.

[4]白雪飞.苦参碱对宫颈癌SiHa细胞中TSLC1基因表达的影响[D].兰州大学，2011.

[5]徐加英.血根碱抗宫颈癌作用及其机制的研究[D].苏州大学，2013.

[6]刘楠，刘国炳，李璇.胰岛素样生长因子受体抑制剂对宫颈癌细胞的抑制作用[J].中国优生与遗传杂志，2011，01：31-32+34.