ＮＳ特异性干扰载体ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ的构建及鉴定

ＮＳ特异性干扰载体ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ的构建及鉴定

高鸿霞１王国庆１（通讯作者）刘燕１霍中华２

高鸿霞１王国庆１（通讯作者）刘燕１霍中华２（１北华大学医学检验学院吉林吉林１３２０１３）（２北华大学附属医院吉林吉林１３２０１３）

【中图分类号】Ｒ７８【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１０

【摘要】摘要：目的核干细胞因子（ｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ，ＮＳ）可能成为肿瘤基因治疗的潜在靶点，本文旨在构建靶向ＮＳ干扰载体ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ，为后续实验奠定基础。方法基于已发布的ＮＳｍＲＮＡ序列（ＮＭ＿２０６８２５），选取５′－ＡＡＧＣＣＴＡＧＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧ－３′（３９７－４１６）作为候选靶序列，按ｓｈＲＮＡ载体设计原则，设计合成两条互补ＤＮＡ链，退火后插入载体，并以酶切和测序鉴定重组转化子。结果经酶切及测序鉴定证实合成序列正确插入载体。结论成功构建ＮＳ特异性干扰载体ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ，可用于ＮＳ在乳腺癌中的功能研究。

【关键词】ｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ基因ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１载体发夹状ＲＮＡＲＮＡ干扰核干细胞因子（ｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ，ＮＳ）是２００２年发现并命名的一个新蛋白，存在于多种干细胞和癌细胞的核仁中，可能是维持干细胞和癌细胞增殖所必须的蛋白质，是干细胞和肿瘤细胞通过Ｇ２／Ｍ检验点的特异性调控因子［１］。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）技术可高效、特异性促使ｍＲＮＡ降解，从而阻断体内特定基因表达，诱使细胞出现特定基因缺失表型。在研究基因功能时，ＲＮＡｉ在一定程度上已逐渐代替转基因和基因敲除技术。为进一步研究ＮＳ在乳腺癌中的作用，本研究拟构建ＮＳ特异性ＲＮＡｉ载体，为后续实验奠定基础。

１材料和方法１．１材料质粒及菌株空载体ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１（武汉晶赛公司）；大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（本室保存）。主要试剂Ｔ４连接酶、限制性内切酶ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ及ＳａｌⅠ（Ｔａｋａｒａ公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（ＧＩＢＣＯ公司）；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（ＯＭＥＧＡ公司）；ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００、１ｋｂｌａｄｄｅｒ）（ＴｒａｎｓＧｅｎｅ公司）；引物合成（上海英骏公司）。

１．２方法１．２．１真核表达载体ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１结构该载体以Ｕ６启动子驱动表达ｓｈＲＮＡ，ＥＧＦＰ指示转染效率。抗Ｋａｎ基因和抗ｎｅｏ基因分别为载体转化大肠杆菌和转染真核细胞的筛选标志。

１．２．２ＮＳ特异性ｓｈＲＮＡ设计与合成根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的人类ＮＳｍＲＮＡ（ＮＭ＿２０６８２５）选取５′－ＡＡＧＣＣＴＡＧＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧ－３′（３９７－４１６）作为候选靶序列，按ｓｈＲＮＡ载体设计原则及载体ＭＣＳ位点结构，设计的寡核苷酸结构包括：ＢａｍＨⅠ＋ｓｅｎｓｅ＋ｌｏｏｐ＋ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＋终止信号ＳａｌＩ＋ＨｉｎｄⅢ，另外一条与之互补，序列如下：ＮＳ的正义链（ＮＳＦ）：５′－ＧＡＴＣＣＧＣＣＴＡＧＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡｔｔｃａａｇａｇａＴＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡ－３′；ＮＳ的互补链（ＮＳＲ）：５′－ＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡｔｃｔｃｔｔｇａａＴＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＧＧＣＧ－３′。

１．２．３ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ的构建两条寡核苷酸单链退火形成ｄｓＤＮＡ，以ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切质粒ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１，１％琼脂糖电泳，按凝胶回收试剂盒操作步骤回收双酶切后质粒大片段，在Ｔ４连接酶存在下，与ｄｓＤＮＡ１６℃过夜连接，连接产物转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α。

１．２．４ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ的酶切及测序鉴定在转化平板上随机挑取单克隆菌落，加入含卡那霉素（５０ｍｇ／Ｌ）的ＬＢ液体培养基中增菌，提取质粒，以空质粒为对照，以ＰｓｔⅠ和ＳａｌⅠ酶切，１％琼脂糖凝胶电泳，鉴定重组转化子。初步鉴定为阳性的重组质粒以Ｕ６启动子通用测序引物测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ。

２结果２．１酶切鉴定阳性转化子重组质粒经ＰｓｔⅠ和ＳａｌⅠ酶切，结果见图１。空载体可被ＰｓｔⅠ酶切形成线性ＤＮＡ（１泳道），经ＳａｌⅠ酶切形成约３５０ｂｐ的条带（２泳道）；而重组质粒因ＰｓｔⅠ位点被破坏，无法切开（４泳道），经ＳａｌⅠ酶切后，出现一条约４００ｂｐ的条带（５泳道），说明质粒重组成功。

图１ＰｓｔⅠ与ＳａｌⅠ酶切鉴定重组质粒电泳结果Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ：１．０ｋｂｐｌｕｓＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１－３．质粒ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１；４－６．重组质粒；１，４．ＰｓｔⅠ酶切；２，５．ＳａｌⅠ酶切；３，６．对照２．２重组质粒测序结果酶切初步鉴定重组成功的质粒以Ｕ６通用测序引物测序，结果见图３。插入的ｄｓＤＮＡ（４３－１０７ｎｔ）序列与设计完全相同，说明载体构建成功，将其命名为ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ。

３讨论图２重组质粒ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ插入ｓｈＤＮＡ序列分析结果目前研究认为ＮＳ蛋白在干细胞、多种肿瘤细胞中高表达，在终末分化的细胞中不表达，可调节细胞增殖及周期进展，参与多种肿瘤的发生发展［１］。通过ＲＮＡｉ技术沉默ＮＳ表达，肿瘤细胞增殖率和体内成瘤能力明显降低［２］，出现肿瘤细胞分化及凋亡［３］。ＮＳ基因和蛋白的发现以及证实的其在肿瘤中的增殖作用使它可能成为肿瘤基因治疗的又一个潜在靶位。但ＮＳ在肿瘤发生、发展和转移过程中如何发挥作用尚需进一步的研究［４］。本研究成功构建了ｐＧｅｎｅｓｉｌ－１－ＮＳ真核干扰载体，可为后续实验奠定基础。

基金项目吉林省卫生厅（２０１２Ｚ０３２／２０１３Ｚ０５４／２０１４Ｚ０７７）；吉林市科技创新服务平台（２０１３６２５０２７）参考文献［１］ＴｓａｉＲＹ．ＭｃＫａｙＲＤ．Ａｎｕｃｌｅｏｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２［２］吴鑫，胡琳，田明妹，等．核干细胞因子的最新研究进展［Ｊ］．四川生理科学杂志，２０１３