浅谈干细胞移植的理论基础及临床应用

浅谈干细胞移植的理论基础及临床应用

刘欣

刘欣（西昌市凉山卫校病理教研室四川西昌615000）

【中图分类号】R33【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)36-0252-03

生命科学是20世纪末和本世纪初自然科学中发展最为迅猛的学科。干细胞的研究与应用成为其中最令人注目的领域之一，“干细胞研究的新发现”在美国《科学》（Science）杂志公布的1999年的十大科学成果中名列榜首，并于2000年再度入选世界十大科学成果。目前，干细胞研究几乎应用于生命科学和生物医药的所有领域。著名的生物学家E.BWilson曾经说过：“所有生物学的答案最终都要到细胞中去寻找，因为所有生物体都是，或曾经是一个细胞。”本文就干细胞近年来在其生物学特性及临床应用方面的进展做一综述。

1干细胞移植概况

我们人体是由400万亿到600万亿个细胞所组成，共230多种，分两大类。第一类是功能细胞，人体的各种各样的生理活动就是这些细胞生命活动的体现。比如，心脏就是由心肌细胞构成的，它们有节律的收缩和舒张完成了心脏的生理功能；人的思维，也正是由大脑中的神经元细胞相互传递信息来完成。可以说，正是因为功能细胞功能完整、活跃，我们才能保持年轻、健康和富有活力。但是，细胞同人一样，也会死亡。正常的细胞凋亡和外界因素导致的细胞坏死，都会使人每天损失大量的功能细胞，这就需要另一类细胞来新生出功能细胞来代替凋亡和坏死的细胞，这类能够产生新的功能细胞的细胞就是干细胞。在人体各个组织器官当中都有干细胞的存在，他们的数量和质量决定了组织器官的功能状态。干细胞也是生命体，他们的生命过程也是按照发生、发育、成熟、衰老和死亡的自然规律进行的，随着年龄的增长，体内干细胞的数量和质量也在逐渐下降，无法按照机体的需求，新生出年轻、健康的细胞，替换组织中衰老病变的细胞，最终反应出人的衰老和疾病。所以恢复体内活跃干细胞的数量，是抑制衰老、预防治疗各种疾病的关键。

我国的干细胞研究和应用已经具备了一定的基础，早在20世纪60年代就开始了骨髓干细胞移植方面的研究，目前研究和应用得最多的是造血干细胞。1992年，我国内地第一个骨髓移植非亲属供者登记组在北京成立，“中华骨髓库”也正式接受捐赠。2002年，北京建立了脐带血干细胞库。关于胚胎干细胞的研究，我国目前还没有明确的法律规定。干细胞移植在临床上主要应用在细胞替代治疗、基因治疗、组织工程。但综合目前众多的研究成果来看,现在干细胞在临床上应用尚不成熟,处于起步阶段,大多数的治疗性研究尚处于动物模型治疗,且疗效及重复性不是十分理想。但由于干细胞独特的自我更新及分化潜能,相信不久的将来干细胞治疗将会引起医学界翻天覆地的变化。

2干细胞移植的理论基础

干细胞具有多种生物学特性,最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。干细胞本身不是处于分化途径的终端,它可连续分裂几代,也可在较长时间保持静止状态;干细胞通过两种方式生长,一种是分裂形成两个相同的干细胞,另一种是非对称分裂,一个子细胞最终分化为功能细胞,另一个分裂成为干细胞保留下来;干细胞表现出很强的可塑性,其调控机制目前尚未清楚。

2.1干细胞的定义干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞,具有无限分裂能力。根据干细胞分化阶段的不同,大致分为胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)和成体干细胞(adultstemcell,ASC)。胚胎干细胞主要包括受精卵分裂发育成囊胚时内层细胞团,以及从早期胎儿生殖嵴分离得到的胚胎生殖嵴细胞,这两种细胞均具有全能性,可分化为各种类型的体细胞,甚至可独立地产生完整的机体。成体干细胞存在于成人的各种组织中,参与组织更新、创伤修复等过程。它能进行“横向分化”(或称其为“可塑性”),即由一种组织的成体干细胞分化成其它组织细胞,这种跨系或跨胚层分化现象称为横向分化。目前研究较多的成体干细胞有:神经干细胞(NSC)、造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)、表皮干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、心肌干细胞、视网膜干细胞、角膜干细胞等。

2.2干细胞分类及生物学特性胚胎干细胞(ESC)的生物学特性：ES细胞具有早期胚胎细胞相似的结构特征,有较高的核质比和正常的整倍体核型。胚胎细胞在发育的不同阶段,其细胞表面出现不同的抗原。未分化的人ES细胞表面SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等呈阳性,而未分化的小鼠ES细胞表面仅SSEA-1抗原阳性。未分化的ES细胞表达高水平的端粒酶活性和转录因子Oct-4,碱性磷酸酶染色呈阳性。胚胎干细胞的表面抗原是指在胚胎干细胞未分化状态下高度表达,一旦分化,基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达,可成为鉴定胚胎干细胞的依据。

成体干细胞的生物学特性：成体干细胞(ASC)是一类具有自我更新,高度增殖和多分化潜能的细胞群,有横向分化能力。目前国内外学者研究热点是其横向分化能力。其机制还不清楚,目前被大家接受的观点主要有以下几种:

(1)异质干细胞的存在;

(2)原始多能干细胞的持续存在。美国的学者JiangY等提出成体骨髓中确实存在一类被称为多潜能的成体干细胞(MAPC),MAPC表达Oct-4、Rex-1,虽然较ES细胞表达低,但一般的成体干细胞不表达;

(3)细胞融合,移植的细胞与不同谱系的宿主细胞自发融合,导致遗传信息的转移,形成的杂合细胞遗传了两个亲代细胞的特征,如TeradaN等研究证实骨髓基质细胞通过细胞融合表现出其他细胞的表型。

ASC的鉴定识别主要通过三种途径：分离培养和形态学观察;免疫表型鉴定;分化功能检测。分离培养和形态学观察是最直接简单的鉴别方法:如利用间充质干细胞(MSC)在培养瓶中可贴壁生长的特点,弃去未贴壁细胞,得到MSC集落,用显微镜观察细胞形态来辨别细胞。免疫表型鉴定是目前研究最多的,虽然其特异性比较高,但所需的实验条件较高,表面抗原试剂价格昂贵,且由于大多数成体细胞没有独特的免疫标记物,只能通过排除其他细胞来确定是否为目的细胞来识别鉴定:只有造血干细胞具有特异性的表面抗原CD34+,而MSC就没有特异性表面抗原,它不表达CD34、CD14、CD45,只表达SH2、SH3、CD29、CD106、CD166。分化功能检测法主要是通过观察ASC诱导分化是否能生成预期的细胞类型来反证是否该种类型的干细胞:如MSC可诱导生成成骨细胞及软骨细胞,只要通过染色等方法证实诱导生成的细胞是成骨细胞或软骨细胞即可证明是MSC细胞,此法在目前的研究中用到比较多。

3干细胞移植的目前现状

干细胞移植在临床上主要应用在细胞替代治疗、基因治疗、组织工程。当组织损伤后．骨髓内的干细胞和组织内的干细胞都可以进入损伤部位，进一步分化成熟来修复受损组织的结构和功能。以下将介绍干细胞移植在骨髓组织、肝脏、脑、肌肉和表皮损伤中的应用。

3.1骨髓组织骨髓组织内有两类干细胞，即造血干细胞和骨髓间充质干细胞。造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血和脐带血中。造血干细胞的基本特征是具有自我维持和自我更新能力，即干细胞通过不对称性的有丝分裂，不断产生大量祖细胞并使其保持不分化状态。造血干细胞的另一个特点是具有可塑性。可以分化为肝脏、肌肉及神经组织细胞，一定条件下肌肉干细胞、神经干细胞还可以分化为造血干细胞．参与相应组织的修复。

在临床治疗中，造血干细胞应用较早。造血干细胞移植，就是应用超大剂量化疗和放疗以最大限度杀灭患者体内的白血病细胞，同时全面摧毁其免疫和造血功能，然后将正常人造血干细胞输入患者体内。重建造血和免疫功能，达到治疗疾病的目的。除了可以治疗急性白血病和慢性白血病外，造血干细胞移植也可以用于治疗重型再生障碍性贫血、地中海贫血、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统疾病以及小细胞肺癌、乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等多种实体肿瘤。对急性白血病无供体者，也可以在治疗完全缓解后采取自身造血干细胞用于移植，称自体造血干细胞移植。

间充质干细胞(mesenchvlaaalstemcell，MSC)是骨髓中的另一种成体干细胞，具有干细胞的共性。最近研究发现人的骨骼肌、脂肪、骨膜、脐血、外周血中亦存在间充质干细胞，与造血干细胞有相同的作用。由于间充质干细胞具有向骨、软骨、脂肪、肌肉及肌腱等组织分化的潜能，因而利用它进行组织工程学研究有如下优势：①取材方便且对机体无害。间充质干细胞可取自自体骨髓，简单的骨髓穿刺即可获得；②由于间充质干细胞取自自体，由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥问题；⑧由于问充质干细胞分化的组织类型广泛，理论上能分化为所有的间质组织类型，如分化为骨、软骨或肌肉、肌腱，在治疗创伤性疾病中具有应用价值；分化为心肌组织，可构建人工心脏；分化为真皮组织，则在烧伤治疗中有广泛的应用前景。

3.2脑20世纪90年代初．研究者在脑组织中分离出能够不断分裂增殖．具有多分化潜能的细胞群落，提出了神经干细胞的概念。脑内的神经干细胞是多能干细胞。它可以进一步分化为脑内三种类型细胞—神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。依据其体外培养时对丝裂原反应性的不同，分为EGF反应型细胞和FGF-2反应型细胞，前者多分化为胶质细胞。后者多分化为神经元表型祖细胞。细胞因子对其分化起重要作用，在人工干预下，睫状神经营养因子(CNTF)可使其向星形胶质细胞分化；而胰岛素样生长因子1(IGF-1)、血小板源性生长因子(PDGF)和维A酸等可增加神经干细胞向神经表型分化。神经干细胞的分化能力不仅仅局限于神经系统．在适当的微环境中神经干细胞具有向其他组织细胞多向分化的能力。如TGF-β可诱导神经干细胞分化为平滑肌细胞。如果把神经干细胞植入骨髓，他们可分化为血细胞，而移入肌肉则可产生肌细胞。

3.3表皮组织自我更新的表皮含有干细胞，后者是皮肤发生、修复、改建的关键性源泉。表皮干细胞为组织特异性干细胞，在胎儿期主要集中于初级表皮嵴，至成人时呈片状分布在表皮基底层。在毛囊隆突部含有丰富的干细胞，而在没有毛发的部位如手掌、脚掌，表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层。

3.4角膜在角膜和结膜的移行区，即角膜缘的基底部存在角膜缘干细胞，角膜缘干细胞不仅可以分化、增殖为上皮细胞，而且在保持角膜的生理生化环境、完整性和维持局部免疫反应中占有重要地位。更重要的是干细胞像一道屏障，阻止结膜上皮细胞移行至角膜表面．这对于保持角膜的透明性与正常生理功能有重要意义。

3.5肝脏目前已确认在肝脏的赫伶管，即肝实质细胞和胆管系统结合部位存在干细胞，具有分化成胆管上皮细胞和肝细胞的双向潜能。在肝功能衰竭、肝癌、慢性肝炎和肝硬化时，可见此种细胞明显增生，参与损伤肝脏的修复。

3.6骨骼肌和心肌骨骼肌细胞属于永久性细胞，但损伤的骨骼肌的再生可由干细胞来完成,后者位于骨骼肌细胞肌膜下，也被称为肌卫星细胞。当骨骼肌损伤后干细胞增殖分化形成肌细胞。到目前为止还没有发现心肌组织内有干细胞。

4干细胞移植的发展及未来前景

干细胞研究虽然有很大的进展,但仍需解决许多难题。1.干细胞的分离、纯化、增殖、鉴定的问题:这个问题是所有问题的起点,如果没有扎实可靠的分离培养技术,也就没法进行后续实验研究。没有有效的增殖技术,就达不到细胞移植等治疗所需要的细胞数量。干细胞的纯化及鉴定目前虽然研究很多,但由于许多干细胞没有独特的表面抗原,所以其鉴定问题将是一大难题,需要各国科学家们进一步研究。2.干细胞诱导分化的问题:每种组织细胞产生的诱导条件不同,这就需要研究者们后续摸索前进。3.移植后免疫排斥反应:干细胞治疗虽然有广阔的应用前景,但利用ES细胞移植或异体干细胞移植治疗疾病过程中免疫相容性问题必须解决。一种解决ES细胞移植排斥反应的方法是从病人自身细胞的核移植分离hES细胞,这个概念称为“治疗性克隆”;还可以通过暂时服用免疫抑制剂,然后逐渐停止服药;也可使用微胶囊法来阻止移植物与受体免疫系统间的相互作用等方法。4.干细胞治疗中生物安全问题:干细胞在移植到体内后是否会分化成其他意料外的组织或引发其他疾病,这些都需要进一步的实验证实。其他的如伦理学和社会问题等等,需要学术界与政府机构共同协作,为干细胞的研究更上一层楼而努力。

总之，利用造血干细胞移植技术已经逐渐成为治疗白血病、各种恶性肿瘤放化疗后引起的造血系统和免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段。用神经干细胞替代已被破坏的神经细胞，有望使因脊髓损伤而瘫痪的病人重新站立起来；不久的将来，失明、帕金森氏综合症、艾滋病、老年性痴呆、心肌梗塞和糖尿病等绝大多数疾病的患者，都可望借助干细胞移植手术获得康复。